三角褐指藻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在碳流分配中的功能.pdf

1、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）光合效率高，繁殖周期短，脂肪酸含量較高，使其具有生產(chǎn)生物柴油的潛力。三角褐指藻目前已完成全基因組測(cè)序，高效的基因槍、電穿孔轉(zhuǎn)化體系也已成功構(gòu)建，可實(shí)現(xiàn)RNA介導(dǎo)的基因沉默，使其成為一個(gè)更具吸引力的探索基因功能的模型系統(tǒng)。β-1，3葡聚糖（金藻昆布多糖）是三角褐指藻的主要儲(chǔ)存多糖，其合成底物尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，由尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose p

2、yrophosphorylase，UGPase)催化可逆反應(yīng)UTP+G-1-P←→UDPG+PPi生成。馬鈴薯(Solanumtuberosum L)、甘蔗（Saccharum officinarum）、擬南芥(Arabidopsis thaliana)等高等植物UGPase的研究表明，UGPase是碳水化合物代謝途徑中的關(guān)鍵酶，并在碳流的分配過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。為了闡明三角褐指藻UGPase的功能及其對(duì)碳流分配的影響，本實(shí)驗(yàn)主要

3、包括兩部分內(nèi)容:
　　第一部分，根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，選取不同的磷濃度和溫度對(duì)三角褐指藻進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)定5個(gè)磷梯度和4個(gè)溫度梯度，將三角褐指藻培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)末期;然后采用實(shí)時(shí)定量PCR(QRT-PCR)技術(shù)分析UGPase基因(UGP)的轉(zhuǎn)錄水平，測(cè)定UGPase的酶活和金藻昆布多糖的含量。初步確定三角褐指藻UGP受磷濃度和溫度調(diào)控的表達(dá)模式。
　　第二部分，首先依據(jù)三角褐指藻的全基因組測(cè)序結(jié)果，對(duì)UGP進(jìn)行初步的信息學(xué)分

4、析。根據(jù)UGP的信息學(xué)分析結(jié)果，以遺傳轉(zhuǎn)化載體pha-T1為骨架，構(gòu)建反向重復(fù)干擾載體(pUGP-IR)和反義干擾載體(pUGP-AS516，pUGP-AS237)。將這些干擾結(jié)構(gòu)用基因槍分別轉(zhuǎn)入三角褐指藻的基因組。然后我們先用博來(lái)霉素(Zeocin)初步篩選出陽(yáng)性克隆，再用PCR技術(shù)檢測(cè)抗性基因ble。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步采用LAPCR技術(shù)對(duì)干擾載體的整合位點(diǎn)進(jìn)行定位。最后我們對(duì)轉(zhuǎn)基因藻株進(jìn)行進(jìn)一步的研究，分別測(cè)定它們的生長(zhǎng)曲線和比

5、生長(zhǎng)速率，通過(guò)QRT-PCR對(duì)UGP的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，測(cè)定UGPase的酶活，金藻昆布多糖的含量，總脂的合成量等指標(biāo)。初步確定三角褐指藻UGPase的功能及其在碳流分配中的作用。
　　第一部分實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明:隨著磷濃度的升高，三角褐指藻內(nèi)UGP的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，UGPase的活性升高，同時(shí)檢測(cè)到金藻昆布多糖的含量增加。無(wú)磷組的藻株，金藻昆布多糖的含量?jī)H占細(xì)胞干重的5％，比對(duì)照組降低了57％，對(duì)應(yīng)的UGP的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)了51％，

6、UGPase酶活也降低了3倍;隨著溫度的逐漸降低，藻細(xì)胞內(nèi)UGP轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，UGPase的活性降低，金藻昆布多糖的合成量減少。10℃組藻細(xì)胞金藻昆布多糖的合成量最高(16.7％)，比對(duì)照組(12％)增加了35％，對(duì)應(yīng)的對(duì)應(yīng)的UGP的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了21％，UGPase酶活也增加了35％。本研究表明磷對(duì)三角褐指藻UGPase起著正調(diào)控作用，溫度對(duì)三角褐指藻UGPase起著負(fù)調(diào)控作用。此外我們推測(cè)UGPase可能是金藻昆布多糖合成途徑的關(guān)鍵

7、酶。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)轉(zhuǎn)基因藻株的UGP轉(zhuǎn)錄豐度較野生型三角褐指藻下調(diào)4.89倍時(shí)，伴隨著UGPase的活性下降69％，對(duì)應(yīng)的金藻昆布多糖含量也降低了54.79％，僅占細(xì)胞干重的5％，總脂的合成量卻增加了15％。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)手段使三角褐指藻UGPase失活，導(dǎo)致金藻昆布多糖的含量顯著降低，使得更多的總脂積累。這些結(jié)果表明，三角褐指藻的UGPase是金藻昆布多糖合成途徑的限速酶，在金藻昆布多糖和脂質(zhì)的生物合成