PXR基因多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、背景：
　　非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是近年來被人們逐漸認識的一種多因素導致的肝細胞內(nèi)脂肪蓄積過多的慢性進展性病變。隨著社會發(fā)展和生活方式的變化，環(huán)境污染、藥物濫用的廣泛存在，近年來NAFLD在全球的發(fā)病率不斷攀高，對人類的健康和社會的發(fā)展構(gòu)成嚴重危害。+（PXR）是核受體超家族NR1I2的成員之一，在新陳代謝、機體生長發(fā)育以及病理生理過程等方面都發(fā)揮著重要的功能，近年發(fā)現(xiàn)其在糖異生、脂類代謝以及膽汁平衡中也具有重要的作用。

2、前期研究發(fā)現(xiàn)PXR在防御外源物侵襲，加速其體內(nèi)代謝和排出的同時，也會導致肝脂肪性病變等損傷的發(fā)生。
　　目的：
　　通過研究，探討PXR基因的單核苷酸多態(tài)性與NAFLD的相關(guān)性，明確PXR在NAFLD中的關(guān)鍵作用。
　　方法：
　　1、采用一代測序檢查PXR外顯子2中SNP，統(tǒng)計分析其SNP與NAFLD的關(guān)聯(lián)性。收集100例臨床外周血液，分為NAFLD組和健康對照組。其中NAFLD組51人，健康對照組49人。分別

3、提取各樣品DNA進行聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR），用1％瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增得到的目的片段542bp，對PCR產(chǎn)物進行測序。統(tǒng)計分析測序結(jié)果，計算相應(yīng)的基因頻率和基因型頻率以及各基因型分布在兩組間的差異，通過Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測分析樣本是否具有群體代表性。
　　2、采用一代測序檢查PXR外顯子4中SNP，統(tǒng)計分析其SNP與NAFLD的關(guān)聯(lián)性。收集100例臨床外周血液，分為NAFLD組和健康對照組，分組情況同上。利

4、用東盛生物試劑盒提取各樣品DNA，利用超微量蛋白核酸分析儀檢測提取出的DNA是否符合要求。將符合要求的DNA進行PCR實驗，用3%瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增得到的目的片段722bp，對PCR產(chǎn)物進行測序。計算相應(yīng)基因頻率和基因型頻率，統(tǒng)計分析各基因型在兩組間的分布情況，通過Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測分析樣本是否具有群體代表性。
　　3、采用一代測序檢查PXR外顯子6中SNP，統(tǒng)計分析其SNP與NAFLD的關(guān)聯(lián)性。樣品來源

5、及分組同上。實驗流程與上述相似。利用試劑盒提取各樣品DNA后進行PCR實驗，PCR產(chǎn)物進行3%瓊脂糖凝膠電泳實驗，判斷PCR得到所需目的片段250bp。PCR產(chǎn)物測序。通過Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測分析樣本是否具有群體代表性，統(tǒng)計分析相應(yīng)基因頻率和基因型頻率。
　　4、采用一代測序檢查PXR外顯子8中SNP，統(tǒng)計分析其SNP與NAFLD的關(guān)聯(lián)性。樣品來源及分組同上。DNA提取方法同上，提取DNA后進行PCR實驗，PC

6、R產(chǎn)物進行3%瓊脂糖凝膠電泳實驗判斷是否得到210bp目的片段。PCR產(chǎn)物測序。通過Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測分析樣本是否具有群體代表性，統(tǒng)計分析相應(yīng)基因頻率和基因型頻率。
　　5、采用一代測序檢查PXR基因rs2461823位點，統(tǒng)計分析其與NAFLD的關(guān)聯(lián)性。收集300例臨床外周血樣，其中NAFLD組153人，健康對照組147人。從各樣品種提取DNA，選擇合格DNA進行PCR實驗，PCR產(chǎn)物進行3%瓊脂糖凝膠電泳

7、驗證PCR產(chǎn)物為383bp目的片段，PCR產(chǎn)物測序。統(tǒng)計分析測序結(jié)果計算相應(yīng)基因頻率和基因型頻率，通過Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測分析樣本是否具有群體代表性。
　　6、采用一代測序檢查PXR基因rs7643645位點，統(tǒng)計分析其與NAFLD的關(guān)聯(lián)性。實驗樣品來源分組及DNA提取、PCR方法同5。PCR產(chǎn)物進行3%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物為256bp目的片段，PCR產(chǎn)物測序。統(tǒng)計分析測序結(jié)果計算相應(yīng)基因頻率和基因型頻

8、率，通過Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測分析樣本是否具有群體代表性。
　　7、基于目標區(qū)域捕獲測序方法探討PXR基因SNP位點與NAFLD的關(guān)聯(lián)性研究。收集20例臨床外周血樣，其中NAFLD組10人，健康對照組10人。從各樣品種提取DNA，進行目標區(qū)域捕獲測序，并對PXR基因多態(tài)性位點關(guān)聯(lián)分析。
　　結(jié)果：
　　1、在PXR基因外顯子2中發(fā)現(xiàn)兩個SNP位點，稱之為突變1、突變2。結(jié)果顯示突變1：兩組比較其基因型

9、總體分布差異沒有統(tǒng)計學意義（χ2=1.77。P>0.05）。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，χ2=0.29，0.750.05），說明樣品具有群體代表性。突變2：兩組比較其總體分布差異沒有統(tǒng)計學意義（χ2=0.10，P>0.05）。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，χ2=2.00，0.250.05），說明樣品具有群體代表性。
　　2、在PXR基因

10、外顯子4中發(fā)現(xiàn)1個SNP位點，結(jié)果顯示兩組比較其總體分布差異沒有統(tǒng)計學意義（χ2=0.58，P>0.05）。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，χ2=0.12，0.900.05），說明樣品具有群體代表性。
　　3、在PXR基因外顯子6及外顯子8中暫時未發(fā)現(xiàn)突變位點。
　　4、PXR基因rs2461823位點通過測序結(jié)果分析，兩組間基因型分布比較差異顯著有統(tǒng)計學意義（χ2=71.43，

11、P<0.05）。比較兩組人群各基因型的分布，結(jié)果顯示3種基因型在兩組均有顯著性差異CC（χ2=33.16，P<0.05），TT（χ2=25.86。P<0.05），CT（χ2=50.31，P<0.05）。在等位基因頻率分布分析中，rs2461823位點的等位基因頻率分布有顯著性差異（P<0.0001。OR=0.555，95%CI：0.399-0.773）。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，χ2=1.99，0.25

12、到遺傳平衡（P>0.05），說明樣品具有群體代表性。
　　5、PXR基因rs7643645位點通過測序結(jié)果分析，兩組間基因型分布比較差異顯著有統(tǒng)計學意義（χ2=103.18，P<0.05）。比較兩組人群各基因型的分布，結(jié)果顯示3種基因型在兩組均有顯著性差異，CC（χ2=42.27，P<0.05），TT（χ2=30.72。P<0.05），CT（χ2=52.91，P<0.05）。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，χ2=1.5

13、1，0.250.05），說明樣品具有群體代表性。
　　6、通過高通量測序篩查到PXR中有120個SNP位點，對PXR基因多態(tài)性位點關(guān)聯(lián)分析，P均>0.05。
　　結(jié)論：
　　1、在本文中發(fā)現(xiàn)的PXR基因外顯子2及外顯子4中的突變可能與NAFLD不相關(guān)。
　　2、PXR基因rs2461823位點和rs7643645位點可能與NAFLD相關(guān)，且rs2461823位點含等位基因C的基因