NF-κB p65 siRNA轉(zhuǎn)染體外抑制VSMC增殖和防治移植靜脈內(nèi)膜增生的實驗研究.pdf

1、背景:冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG)是目前用于治療冠狀動脈嚴(yán)重狹窄性病變、改善心肌組織缺血的有效治療方法，自體靜脈是被廣泛用作冠狀動脈旁路移植手術(shù)的靜脈血管材料，然而術(shù)后移植靜脈粥樣硬化性狹窄閉塞嚴(yán)重影響其治療效果。血管壁炎性反應(yīng)和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖、內(nèi)膜增生是靜脈血管橋粥樣硬化再狹窄的重要特征，是多因素造成的血管壁損傷修復(fù)的漸進(jìn)性病理變化過程，多項實驗證實核轉(zhuǎn)錄因子

2、kappa B(NF-κB)是靜脈移植術(shù)后血管壁炎性反應(yīng)、內(nèi)膜VSMC增殖的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，因此RNA干擾技術(shù)阻斷NF-κB表達(dá)，可以有效抑制炎性反應(yīng)、減輕細(xì)胞增殖分化、防止移植靜脈粥樣硬化再狹窄的發(fā)生發(fā)展，通過基因治療學(xué)策略抑制這種病理性增生已經(jīng)成為目前研究的重點。
　　目的:體外細(xì)胞學(xué)實驗研究NF-κB p65基因的siRNA(Small interfering RNA)重組質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染大鼠VSMC，通過VSMC細(xì)

3、胞培養(yǎng)研究p65 siRNA對平滑肌細(xì)胞的增殖活性、凋亡情況及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響。建立大鼠頸外靜脈—腹主動脈自體靜脈移植模型，動物實驗研究p65 siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染移植靜脈，檢測血管組織中NF-κB p65蛋白、炎性因子TNF-α和MCP-1的表達(dá)水平，觀察siRNA對炎性因子表達(dá)的阻斷作用和對移植靜脈血管組織VSMC增殖導(dǎo)致再狹窄的防治效果。
　　方法:通過體外細(xì)胞學(xué)轉(zhuǎn)染實驗及大鼠移植靜脈血管橋轉(zhuǎn)染研究，采用RNA干擾

4、(RNAinterference，RNAi）原理阻斷NF-κB的激活，即通過siRNA達(dá)到目的基因轉(zhuǎn)錄后沉默，減輕炎性反應(yīng)，抑制VSMC增殖，延緩移植靜脈內(nèi)膜增生再狹窄。
　　一、NF-κB p65的siRNA設(shè)計合成和構(gòu)建表達(dá):根據(jù)大鼠NF-κB基因數(shù)據(jù)庫中提供的其p65亞基的基因堿基序列，選定其中（5′-AAG CAC AGA TAC CAC TAA GAC-3′），位于NF-κB基因p65亞基mRNA的211bp-231bp

5、處，是特異的21個堿基的寡核苷酸靶序列區(qū)，應(yīng)用在線RNAi軟件，此21堿基序列通過基因Blast(The Basic Local AlignmentSearch Tool)編碼為特異的短發(fā)夾狀RNA（short hairpin RNA，shRNA），并合成其互補(bǔ)核苷酸鏈，p65寡核苷酸鏈煺火形成雙鏈shRNA，然后將shRNA克隆到含有鼠源mU6啟動子的載體質(zhì)粒pGenesil-1.2中，質(zhì)粒多克隆位點中，SacI酶切位點位于HindⅢ

6、和mU6 promoter之間，構(gòu)建的載體質(zhì)粒含有抗卡那霉素基因，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后能抵抗培養(yǎng)皿中卡那霉素，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可形成shRNA，并在核糖核酸內(nèi)切酶Dicer作用下形成有功能的siRNA，重組質(zhì)粒為pGenesil-1.2 p65 siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒，用試劑盒行質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增制備，經(jīng)過專業(yè)公司:生工生物工程上海股份有限公司提取測序鑒定，即NF-κB p65 siRNA載體質(zhì)粒用于本實驗研究。
　　二、體外細(xì)胞

7、學(xué)實驗:清潔級Wistar大鼠，購于山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，體質(zhì)量200g-300g，采用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，分離切取胸主動脈，游離血管平滑肌層，采用改良的組織塊貼壁法進(jìn)行主動脈血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)，將主動脈血管中膜組織剪斷成約1.5*1.5mm大小組織片，約3小時后等血管組織塊黏在培養(yǎng)瓶底部之后翻轉(zhuǎn)過來，1小時后加入含20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，于5％CO2，溫度為37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置，差異貼壁法純化細(xì)胞，常

8、規(guī)胰酶消化法傳代培養(yǎng)，用含20％胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基孵育傳代培養(yǎng)至第4代使用，使平滑肌細(xì)胞貼壁，每3天換液一次，預(yù)防殘留組織中的成纖維細(xì)胞等去除部分雜質(zhì)細(xì)胞成份，傳代時將消化吹打形成的細(xì)胞懸液靜置15分鐘，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)至下一培養(yǎng)瓶中不斷靜置貼壁培養(yǎng)，重復(fù)后可獲得純度較高的平滑肌細(xì)胞。隨后將成功傳代培養(yǎng)的VSMC進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗研究，細(xì)胞隨機(jī)分為正常組（A組:即正常無處理組）;對照組（B組:空白質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物處理組）和轉(zhuǎn)染組（C組

9、:NF-κB p65 siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞），使用倒置相差顯微鏡進(jìn)行VSMC形態(tài)學(xué)觀察和免疫化學(xué)染色鑒定，并觀察VSMC轉(zhuǎn)染效果，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，MTT法檢測各組培養(yǎng)的VSMC增殖程度情況，WestemBlotting法檢測各組細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)量的變化。
　　三、動物模型制作及動物實驗:NF-κB p65 siRNA載體質(zhì)粒用于動物實驗研究，體質(zhì)量約200g-300g左右的雄性Wistar

10、大鼠，制作大鼠自體頸外靜脈——腎下腹主動脈的血管移植模型，采用10％水合氯醛溶液3 ml/kg腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)板，頸部和腹部正中區(qū)域皮膚剃毛，消毒鋪無菌孔巾，頸部切口分離右側(cè)頸外靜脈主干并結(jié)扎其多余分支，應(yīng)用套管法將靜脈兩端翻轉(zhuǎn)于18G靜脈留置針片段套管中，3/0細(xì)絲線固定，縫合頸部切口;大鼠腹部正中切口后，紗布分隔腸道組織，游離并用血管夾阻斷腎下腹主動脈，將翻轉(zhuǎn)于套管上的頸外靜脈遠(yuǎn)心端套扎固定于腹主動脈近心端，同樣方法套扎吻合

11、動、靜脈另一端，開放血管夾后靜脈血管橋可見明顯血流充盈及搏動，依次縫合關(guān)腹。NF-κB p65 siRNA載體質(zhì)粒用于動物實驗研究:其中雄性Wistar大鼠60只隨機(jī)分為A組:n=10，正常靜脈血管;B組:n=10，單純進(jìn)行靜脈移植;C組:n=20，對照質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染移植靜脈血管橋和D組:n=20，基因轉(zhuǎn)染組采用NF-κB p65的siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染移植靜脈血管橋。移植靜脈血管橋的siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)轉(zhuǎn)染:移植前采用si

12、RNA質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物1ml浸泡沖洗切取的自體頸外靜脈血管20min、并30mmHg加壓灌注5min，靜脈血管橋吻合移植后血管外膜應(yīng)用siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物1ml涂抹轉(zhuǎn)染，術(shù)后相應(yīng)時間取靜脈血管組織觀察血管壁內(nèi)膜中膜形態(tài)學(xué)變化，測定內(nèi)膜和中膜平滑肌厚度，免疫組化檢測移植血管組織增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)水平，采用WesternBioting測定各組移植靜脈血管組織中NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平，PCR測定血管壁組織中炎性因子MC

13、P-1和TNF-α的mRNA含量，其中PCR和WesternBloting測定過程中，內(nèi)源性管家基因β-actin作為內(nèi)參照，結(jié)果用于統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:體外細(xì)胞學(xué)實驗成功培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC，形態(tài)學(xué)觀察可見平滑肌細(xì)胞呈特征性的峰谷狀樣生長，局部出現(xiàn)細(xì)胞聚集區(qū)，免疫化學(xué)染色鑒定VSMC，通過NF-κB p65siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞，WesternBloting測定細(xì)胞NF-κB p65蛋白，流式細(xì)胞儀檢測V

14、SMC細(xì)胞凋亡情況，以及MTT檢測平滑肌細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示:C組與A、B組相比，其細(xì)胞的增殖活性明顯受到抑制，凋亡細(xì)胞比例明顯增多，增殖速度數(shù)量明顯降低，NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，但A組和B組之間無明顯差異。動物實驗研究中，各組血管組織中相關(guān)炎性因子PCR檢測結(jié)果以及WesternBloting蛋白測定結(jié)果提示，術(shù)后7d，B、C和D組血管橋組織中NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平明顯高于A組靜脈組織，TN

15、F-α和MCP-1表達(dá)水平明顯大于A組(P＜0.05)，B組與C組結(jié)果之間無明顯差異，然而與C組相比，D組血管橋組織中NF-κB p65蛋白水平、炎性因子TNF-α和MCP-1的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，提示經(jīng)過siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染處理后，D組血管橋組織NF-κB和炎性因子的表達(dá)受到明顯抑制。病理組織學(xué)研究中，血管橋管壁厚度測定和PCNA細(xì)胞免疫組化檢測結(jié)果可見:A組正常靜脈血管壁內(nèi)膜和中層厚度較薄，平滑肌細(xì)胞數(shù)較少，

16、很少檢測到PCNA陽性細(xì)胞，靜脈移植術(shù)后14d，B、C組移植靜脈血管橋出現(xiàn)內(nèi)膜和中層平滑肌明顯增厚，平滑肌細(xì)胞增殖活躍，大量PCNA陽性細(xì)胞主要集中于內(nèi)膜及平滑肌層，動脈化程度較重，相對于B和C組血管橋，D組移植靜脈血管壁內(nèi)膜和中層輕度增生，內(nèi)膜厚度較小，PCNA陽性細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:通過siRNA載體質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染VSMC，能夠有效阻斷NF-κB的炎性表達(dá)，減少平滑肌細(xì)胞NF-κB的激活，降

17、低炎性因子NF-κB，MCP-1、TNF-α的表達(dá)，增加細(xì)胞凋亡，抑制VSMC的增殖活性。動物實驗中，采用NF-κB p65 siRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染移植靜脈，可以明顯抑制血管橋組織NF-κB的激活，降低炎性因子NF-κB，MCP-1和TNF-α的表達(dá)，減輕了血管壁炎癥反應(yīng)，降低了移植靜脈血管內(nèi)膜增生和VSMC增殖程度，體內(nèi)和體外實驗揭示了炎性反應(yīng)在靜脈移植后內(nèi)膜增生中的重要作用，提示siRNA治療技術(shù)的有效性，為尋找有效、安全的