尿液exosome分離方法研究.pdf

1、目的：
　　比較3種方法即超速離心法、超濾法和沉淀法對(duì)人尿液來(lái)源exosome分離結(jié)果的影響，并進(jìn)一步探究exosome的最佳分離條件。本研究為臨床上選擇合適的人尿液exosome分離方法提供了參考依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用超速離心法、超濾法及沉淀法分別從20個(gè)健康人和10個(gè)慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患者尿液中分離提取 exosome;用透射電鏡（transmission

2、electron microscope， TEM）觀察 exosome大小形狀，蛋白質(zhì)印跡法（Western-blot）檢測(cè)exosome標(biāo)志蛋白TSG101及Alix以鑒定exosome。
　　2.在尿量及exosome總蛋白量相同情況下，用Western-blot檢測(cè)3種方法分離提取的尿exosome中標(biāo)志蛋白，比較不同分離方法分離尿exosome的效果。
　　3. Western-blot檢測(cè)尿exosome中標(biāo)志蛋白

3、以分析尿液樣本17,000g離心前是否有必要低速離心去除細(xì)胞以及不同離心力（100,000g，150,000g，200,000g及250,000g）、離心時(shí)間（0.5h，1h及2h）及溫度（4℃，25℃及37℃）對(duì)超速離心分離尿液exosome結(jié)果的影響。
　　結(jié)果：
　　1.在透射電鏡下，3種方法分離的exosome都呈圓形或橢圓形囊泡樣結(jié)構(gòu)，直徑40-100nm、包膜完整，腔內(nèi)為均一的低電子密度物質(zhì)。Western-bl

4、ot法檢測(cè)exsome標(biāo)志蛋白TSG101和Alix，結(jié)果顯示，超速離心法及超濾法可以檢測(cè)到exosome標(biāo)志物TSG101、Alix，而超速離心法上清、超濾法濾液、沉淀法沉淀和上清都未能檢測(cè)到。
　　2.在尿量相同情況下，3種分離方法獲得exosome分別進(jìn)行蛋白標(biāo)志物TSG101及Alix檢測(cè)，Western-blot結(jié)果顯示超速離心法印跡條帶灰度最深，且所有樣本均能檢測(cè)出TSG101及Alix蛋白；超濾法獲取的exosome

5、，健康人尿液來(lái)源的exosome均能檢測(cè)出TSG101及Alix蛋白，但在CKD患者均未能檢測(cè)到；而沉淀法在所有樣本均未檢測(cè)到exosome標(biāo)志蛋白。調(diào)整上樣體積使得exosome總蛋白量Western-blot檢測(cè)3種分離方法得到的exosome中的標(biāo)志蛋白，結(jié)果顯示超速離心法分離得到的exosome量最多且在所有樣本均能檢測(cè)到TSG101及Alix蛋白表達(dá)；超濾法在20個(gè)健康人中有11個(gè)人能檢測(cè)到TSG101及Alix，10個(gè)CKD

6、患者未能檢測(cè)到；而沉淀法在所有樣本均未檢測(cè)到exosome志蛋白。
　　3. Western-blot結(jié)果表明，低速離心去除細(xì)胞的尿樣本及未低速離心去除細(xì)胞的尿樣本，分離獲得的exosome印跡條帶灰度無(wú)明顯差異；超速離心法分離尿液exosome，隨著離心力及離心時(shí)間的增加，印跡條帶灰度逐漸加深，250,000g，2h離心條件下分離獲得的exosome印跡條帶灰度最深，而不同溫度條件下，印跡條帶灰度無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：<