同步輻射圓二色光譜學(xué)研究生物大分子結(jié)構(gòu)與功能.pdf

1、本論文主要利用同步輻射真空紫外圓二色(SRCD)光譜學(xué)方法，結(jié)合動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、X射線晶體學(xué)以及原子力顯微鏡(AFM)等實(shí)驗(yàn)方法研究了溶液條件下生物大分子的結(jié)構(gòu)與相變：(1)原發(fā)性痛風(fēng)病人體內(nèi)磷酸核糖焦磷酸合成酶1(PRS1)及其點(diǎn)突變體的溶液構(gòu)象；(2)聚陰離子ATP對(duì)溶菌酶解折疊過(guò)程的影響；(3)絲素蛋白重鏈N端親水區(qū)(Fib-H N domain)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。在二級(jí)結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，分別探討了點(diǎn)突變導(dǎo)致PRS1超活性

2、的機(jī)理、ATP促進(jìn)溶菌酶形成淀粉樣纖維的機(jī)制以及Fib-H N domain在自然紡絲過(guò)程中發(fā)揮的作用。
　　 1、點(diǎn)突變導(dǎo)致PRS1超活性的機(jī)理
　　 本工作表達(dá)純化了PRS1及D52H、N114S、L129I、D183H、A190V和H193Q六個(gè)致病點(diǎn)突變體，酶活性測(cè)試顯示點(diǎn)突變導(dǎo)致酶活性顯著升高。利用SRCD、DLS等方法研究了它們?cè)诮Y(jié)合底物、抑制物前后構(gòu)象與聚集狀態(tài)的變化。研究發(fā)現(xiàn)PRS1蛋白的活性形式并不依賴

3、于其聚集態(tài)，但是底物ATP能夠引起PRS1聚集成六聚體。抑制劑ADP結(jié)合位點(diǎn)位于六聚結(jié)合界面上，所以六聚的形成為ADP進(jìn)行別構(gòu)抑制調(diào)控提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。這一復(fù)雜的酶活性調(diào)控機(jī)制使得酶催化活性處于正常水平。當(dāng)PRS1發(fā)生點(diǎn)突變時(shí)，其聚集能力被顯著弱化，有的點(diǎn)突變甚至導(dǎo)致聚集消失(比如N114S和L129I)，這相應(yīng)的弱化了ADP的別構(gòu)調(diào)控能力。而且SRCD研究發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變導(dǎo)致蛋白底物結(jié)合構(gòu)象改變，晶體結(jié)構(gòu)分析揭示N114S底物結(jié)合構(gòu)象的改變可

4、能會(huì)破壞PO43-別構(gòu)位點(diǎn)。所以點(diǎn)突變導(dǎo)致的底物結(jié)合構(gòu)象的改變也許是酶超活性的另一個(gè)原因。這些因素一起導(dǎo)致酶出現(xiàn)超活性，最終引發(fā)痛風(fēng)。
　　 2、ATP促進(jìn)溶菌酶形成淀粉樣纖維的機(jī)制
　　 利用AFM、SRCD、DSC等方法研究了聚陰離子ATP對(duì)溶菌酶溶液構(gòu)象、解折疊過(guò)程以及淀粉樣纖維形成的影響。研究發(fā)現(xiàn)ATP可以結(jié)合到溶菌酶上，而且ATP磷酸基團(tuán)的強(qiáng)烈靜電效應(yīng)使得溶菌酶上暴露的色氨酸殘基卷入更加疏水的環(huán)境，從而改變了蛋

5、白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在升溫解折疊過(guò)程中，色氨酸殘基位置的改變降低了溶菌酶的熱穩(wěn)定性，導(dǎo)致了二級(jí)結(jié)構(gòu)的非協(xié)同性展開(kāi)，在50℃左右產(chǎn)生了一個(gè)含有相對(duì)豐富螺旋和較少β-片結(jié)構(gòu)的部分展開(kāi)中間體。DLS實(shí)驗(yàn)說(shuō)明部分展開(kāi)中間體相比于天然結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的聚集傾向。此外，ATP非特異性結(jié)合到伸展的多肽鏈上，屏蔽了相應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)，抑制了溶菌酶展開(kāi)過(guò)程的可逆性。因此ATP誘導(dǎo)的溶菌酶的不穩(wěn)定和非協(xié)同性展開(kāi)，是ATP促進(jìn)溶菌酶形成纖維狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)在基礎(chǔ)。同時(shí)也表明，

6、相比于單體的富β-片中間體，淀粉樣纖維片段的變性程度才是纖維形成的關(guān)鍵因素。
　　 3、Fib-H N domain(FN)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變
　　 利用SRCD方法研究了四個(gè)不同長(zhǎng)度的不含信號(hào)肽(1～21位殘基)區(qū)域的FN片段，即FN(22-71)、FN(22-104)、FN(22-126)和FN(22-145)，在不同溶液條件下發(fā)生的Coil-to-β構(gòu)象轉(zhuǎn)變，探討了FN在絲紡織過(guò)程中的功能。結(jié)合AFM等實(shí)驗(yàn)手段，發(fā)現(xiàn)在能夠

7、形成β-片結(jié)構(gòu)的溶液條件下，這些FN片段能夠形成直徑為50-100 nm的納米球狀或者納米囊泡狀結(jié)構(gòu)，而且這些納米球狀結(jié)構(gòu)可以互相融合形成不規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。并且發(fā)現(xiàn)FN片段越長(zhǎng)越容易發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變和形成納米球狀結(jié)構(gòu)。相比于絲素蛋白重鏈中大量的疏水重復(fù)區(qū)段，F(xiàn)ib-H N domain除了增加蛋白溶解度的功能外，可能扮演著一種感受器的角色，能夠迅速感知周?chē)h(huán)境改變的信號(hào)，從而引起整個(gè)絲素蛋白重鏈的構(gòu)象變化。這些納米球狀結(jié)構(gòu)的自組裝可能作為一