α-硫辛酸通過線粒體途徑在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷中抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用研究.pdf

1、目的:
　　通過觀察ALA在大鼠TBI模型中對(duì)大鼠神經(jīng)功能及腦水腫的影響，并通過檢測(cè)腦組織中丙二醛(MDA)的含量和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的活性，用Western blot檢測(cè)分別腦組織線粒體和去線粒體細(xì)胞漿中細(xì)胞色素c蛋白及Bcl-2相關(guān)X蛋白的表達(dá)，采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Caspase-3的表達(dá)，同時(shí)用尼氏(Nissl)染色檢測(cè)皮層區(qū)神經(jīng)元的存活情況以及運(yùn)用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標(biāo)

2、記法(TUNEL）檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡情況。進(jìn)而探討ALA在TBI后抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究ALA治療TBI提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。也為將來TBI的研究和臨床治療提供新的思路和相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)分組
　　本實(shí)驗(yàn)選取健康成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠150只，體重250～280g，均由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。按隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分5組:假手

3、術(shù)+溶劑組、假手術(shù)+ALA(100mg/kg)組、TBI+溶劑組、TBI+ALA（20mg/kg）組、TBI+ALA(100mg/kg)組，各組動(dòng)物均為30只。每組中有12只動(dòng)物用于Western blot檢測(cè);6只動(dòng)物用于腦水腫含量測(cè)定和神經(jīng)功能評(píng)分;6只動(dòng)物用于生化分析;6只動(dòng)物進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)、Nissl染色和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)。
　　2、大鼠TBI模型的建立
　　在這項(xiàng)研究中使用的TBI模型是按照改良的Fee

4、ney法制造的。大鼠麻醉后，外傷組在大鼠頭顱左側(cè)頂骨開一小骨窗，使用重物(40g)從高處(25cm)自由落體垂直撞擊左側(cè)硬腦膜上;假手術(shù)組僅給予左側(cè)頂骨開窗術(shù)。
　　3、藥物的處理
　　將ALA溶解于溶劑（含10％二甲基亞砜溶液的玉米油）中，TBI治療組和假手術(shù)+ALA組在模型制作完成后30min經(jīng)灌胃給予第一次給藥，24 h后重復(fù)給藥一次。假手術(shù)+溶劑組和TBI+溶劑組在相同的時(shí)間點(diǎn)給予等量的溶劑。
　　4、標(biāo)本的取

5、材和制備
　　在致傷后48 h，將大鼠麻醉后，經(jīng)左心室灌注等滲鹽水(4℃)至肝臟發(fā)白后斷頭開顱取腦。其中每組6只大鼠經(jīng)心臟灌注4℃的等滲鹽水后，再經(jīng)同樣途徑灌注4％多聚甲醛，之后開顱取腦，置于4％多聚甲醛中固定，然后石蠟包埋、切片，用于免疫組織組化學(xué)檢測(cè)、Nissl染色及TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)。
　　5、神經(jīng)功能評(píng)分
　　采用平衡木實(shí)驗(yàn)的方法先后在TBI后24 h和48 h對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。所得分值越低表明神經(jīng)功

6、能缺損越嚴(yán)重。
　　6、測(cè)定腦水腫
　　TBI后48 h，神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)束后，將動(dòng)物處死，迅速取腦，并腦干和小腦的去除后，可分別獲得左側(cè)和右側(cè)皮層組織。測(cè)定每個(gè)樣品的濕重，然后在80℃烘箱中干燥72 h，可獲得每個(gè)樣品的干重。用公式計(jì)算腦組織含水量:[（濕重-干重）/濕重]×100％。
　　7、檢測(cè)腦組織MDA含量和GPx活性
　　根據(jù)MDA和GPx檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，用Bradfo

7、rd法測(cè)定總蛋白濃度。MDA含量和GPx活性分別用nmol/mg和U/mg來表示。
　　8、Western blot檢測(cè)
　　將新鮮的腦組織在4℃的條件下按照組織線粒體分離試劑盒說明提取線粒體和去線粒體的細(xì)胞漿蛋白。而腦組織總蛋白同樣在4℃的條件下采用組織裂解法提取，將提取的腦組織蛋白進(jìn)行定量。取適量提取好的蛋白，按4/1的體積比加入loading buffer，100℃水浴10min。然后用于Western blot檢測(cè)。

8、采用10％～12％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)(90V)。分離后的蛋白按常規(guī)轉(zhuǎn)膜方法轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(100V，90min)，將膜置于TBST配置的5％的脫脂奶粉中室溫下?lián)u晃封閉2h，去掉封閉液，加入按相應(yīng)比例稀釋的一抗(Cytochrome c、Bax、Caspase-3、COX IV、β-actin)，4℃過夜。使用TBST洗滌3次，每次10min。然后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記且與一抗相對(duì)應(yīng)的二抗，室

9、溫?fù)u晃孵育2h。再用TBST洗滌3次，每次10min，于暗室內(nèi)加化學(xué)發(fā)光液(ECL)，用X光膠片顯影目標(biāo)蛋白。采用UN-SCAN-IT6.1圖像分析軟件測(cè)量所獲得目標(biāo)蛋白條帶顯色陽性區(qū)的平均灰度值，并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　9、免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry， IHC)檢測(cè)Caspase-3的表達(dá)
　　以致傷灶為中心，將浸泡在4％多聚甲醛的腦組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，然后進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為5μm。將切片常

10、規(guī)脫蠟，水化，抗原修復(fù)，用10％山羊血清封閉1 h(37℃)，然后加入兔來源的Caspase-3抗體（稀釋比例1∶300），在4℃下孵育過夜。PBS洗3次，每次15min，接著用含1.6％H2O2的PBS封閉10min。而后加入HRP標(biāo)記的二抗，在室溫下孵育1h。加DAB顯色，用自來水沖洗，然后蘇木精復(fù)染，再脫水，透明，最后封片。在高倍鏡視野(×400)下每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)，求出平均值（以每100個(gè)細(xì)胞里的陽性細(xì)

11、胞個(gè)數(shù)來表示），最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　10、Nissl染色
　　嚴(yán)格按照Nissl染色液說明的方法將腦組織石蠟切片(5μm)進(jìn)行染色。在高倍鏡視野(×400)下每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野對(duì)存活的神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，求出平均值（以每100個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞里存活的細(xì)胞個(gè)數(shù)來表示存活率），最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　11、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　采用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)腦組織石蠟切片(5μm)進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞凋亡

12、的檢測(cè)。同樣在高倍鏡視野(×400)下每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野對(duì)TUNEL陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，求出平均值（以每100個(gè)細(xì)胞中TUNEL陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)來表示陽性率），然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　12、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（~±SEM）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，但神經(jīng)功能評(píng)分采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)，均以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

13、>　　結(jié)果:
　　1、大體觀察
　　本實(shí)驗(yàn)中所有SD大鼠均來自同一批，各實(shí)驗(yàn)組間大鼠的體重?zé)o明顯差異。TBI模型制作和給藥及溶劑過程中的操作步驟均一致。各實(shí)驗(yàn)組間均未出現(xiàn)大鼠死亡。且各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果來看，假手術(shù)+溶劑組和假手術(shù)+ALA（100mg/kg）組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。在本實(shí)驗(yàn)中，與20mg/kg的劑量相比較，TBI后給予100mg/kg劑量的ALA治療為佳。
　　2、TBI后ALA可改善神經(jīng)功能和減少腦

14、水腫
　　TBI后48小時(shí)內(nèi)，神經(jīng)功能評(píng)分在TBI+溶劑組與假手術(shù)組相比明顯降低(P＜0.001)。給予ALA治療的外傷組神經(jīng)功能評(píng)分雖然低于假手術(shù)組，但相對(duì)于TBI+溶劑組有明顯的改善(P＜0.01)。TBI后48 h測(cè)定的腦組織水含量結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比TBI+溶劑組是增加的(P＜0.001)。ALA治療后腦組織水含量下降(P＜0.05)。
　　3、TBI后ALA減輕腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)
　　MDA作為脂質(zhì)過氧

15、化的指標(biāo)，與假手術(shù)組相比，在TBI+溶劑組中明顯升高（P＜0.01），而給予ALA治療后MDA含量下降(P＜0.01)。GPx屬于抗氧化活性的指標(biāo)，負(fù)責(zé)清除代謝產(chǎn)生的自由基，TBI后其活性下降（P＜0.01，與假手術(shù)組比），而經(jīng)ALA處理后可提高GPx的活性(P＜0.05，與TBI+溶劑組比)。
　　4、TBI后ALA可抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡
　　采用Nissl染色法觀察神經(jīng)元形態(tài)。在TBI+溶劑組可看到神經(jīng)元的存活率明顯下降(

16、P＜0.01)，而在ALA治療組神經(jīng)元存活率較TBI+溶劑組是升高的(P＜0.01)。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)中，與假手術(shù)組相比，TBI+溶劑組TUNEL陽性細(xì)胞增多(P＜0.01)，ALA治療明顯減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡個(gè)數(shù)(P＜0.01)。
　　5、TBI后ALA可下調(diào)Caspase-3的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比較，TBI+溶劑組Caspase-3的表達(dá)升高(P＜0.01)，在TB

17、I經(jīng)ALA治療后Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)降低，同時(shí)其蛋白表達(dá)下降(P＜0.01)。
　　6、TBI后ALA對(duì)線粒體的作用
　　Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，從TBI+溶劑組可見在提取的線粒體中Bax的表達(dá)增多而Cytochrome c的含量減少(P＜0.01)，在去線粒體的細(xì)胞漿蛋白中Bax表達(dá)減少而Cytochrome c的含量增加（P＜0.05）;在給予ALA治療后，與TBI+溶劑組相比，線粒體中

18、Bax的表達(dá)下降而Cytochrome c的含量增加(P＜0.05)，在去線粒體的細(xì)胞漿蛋白中Bax表達(dá)增加而Cytochrome c的含量減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)研究顯示，ALA對(duì)大鼠顱腦損傷具有改善神經(jīng)功能障礙和減輕腦水腫的作用，其神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過減輕氧化應(yīng)激和抑制Bax的易位和Cytochrome c從線粒體的釋放從而抑制線粒體凋亡通路。這些結(jié)果表明，ALA對(duì)TBI后的繼發(fā)性腦損傷具有潛在治