線粒體微粒在創(chuàng)傷性腦損傷相關(guān)凝血功能障礙中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury, TBI）相關(guān)凝血功能障礙（traumatic brain injury-associated coagulopathy, TBI-AC）發(fā)生和死亡率高，其發(fā)生機(jī)制尚不明確。課題組前期已發(fā)表的研究顯示，小鼠 TBI后損傷的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可釋放腦源性微粒（brain derived microparticles, BDMP）通過(guò)破壞的血腦屏障進(jìn)入外周循環(huán)血中引起系統(tǒng)性

2、凝血功能障礙（Blood2015）。本研究將在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究BDMP的亞型線粒體微粒（mitochondrial microparticles, mtMPs）在TBI后小鼠外周血中的含量及其在TBI-AC中的作用，并通過(guò)體外提取mtMPs，檢測(cè)其對(duì)凝血相關(guān)細(xì)胞的作用。同時(shí)檢測(cè)微粒清除蛋白Lactadherin對(duì)mtMPs介導(dǎo)的TBI-AC的治療作用。本研究將豐富TBI-AC發(fā)病機(jī)制的理論，并探索新的TBI-AC及TBI繼發(fā)性損傷的治

3、療方法。
　　方法：（1）通過(guò)小鼠 TBI模型，檢測(cè)小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后外周血抗腦抗體的變化。（2）體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心磷脂（cardiolipin, CL）的促凝活性，并通過(guò)尾靜脈給予正常小鼠體內(nèi)注射不同劑量的CL，檢測(cè)CL在正常小鼠體內(nèi)的促凝作用。通過(guò)掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy, SEM）觀測(cè)CL形成膠團(tuán)結(jié)構(gòu)。（3）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR和掃描電子顯微鏡（ transmission

4、electron microscopy, TEM）檢測(cè)小鼠 TBI后外周血中 mtMPs的釋放，同時(shí)檢測(cè) CL與mtMPs的關(guān)系。（4）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，免疫磁珠分選和多步離心法三種不同方法體外提取mtMPs，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和TEM對(duì)其表型和形態(tài)進(jìn)行鑒定。（5）體外檢測(cè)mtMPs的促凝作用，并通過(guò)小鼠尾靜脈給予正常小鼠體內(nèi)注射mtMPs，通過(guò)凝血因子X(jué)激活凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)，ELISA法檢測(cè)外周血D-dimer含量和組織病理染色，檢測(cè) mtM

5、Ps在正常小鼠體內(nèi)的促凝作用。（6）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR檢測(cè)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞mtMPs的釋放。（7）檢測(cè)mtMPs或CL是否可以激活血小板及其潛在機(jī)制。（8）檢測(cè)mtMPs或CL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間屏障完整性和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的激活。（9）體外檢測(cè)Lactadherin蛋白對(duì)mtMPs介導(dǎo)的促凝作用的抑制作用。
　　結(jié)果：（1）小鼠TBI后外周血中，在傷后10天開(kāi)始可檢測(cè)到抗CL抗體，同時(shí)CL膠團(tuán)在體內(nèi)及體外具有促凝活

6、性，其在體內(nèi)可促進(jìn)小鼠肺組織血管纖維素沉積和微血栓形成。（2）小鼠TBI后6h，檢測(cè)到腦組織中損傷的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞系中線粒體以微粒形式，即線粒體微粒（mtMPs）釋放至外周血中，其含量可達(dá)到17,547±2,677/μl，mtMPs表面暴露CL。這種mtMPs占到了整個(gè)Annexin V+微粒的55.2±12.6％。同時(shí)，體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞系和膠質(zhì)細(xì)胞系在凋亡狀態(tài)下可釋放mtMPs。體外提取的mtMPs可以協(xié)同血小板促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的滲漏

7、。（3）正常小鼠經(jīng)鼠尾靜脈注射入mtMPs30min后，可導(dǎo)致小鼠外周血呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，凝血酶升高，同時(shí)可在小鼠肺組織中檢測(cè)到血管纖維素沉積及肺組織間水腫。（4）mtMPs介導(dǎo)的促凝作用主要是通過(guò)線粒體內(nèi)膜上CL轉(zhuǎn)移至外膜而介導(dǎo)的，其促凝作用可以被微粒清除系統(tǒng)蛋白 Lactadherin所阻斷，而這種 mtMPs上的CL的促凝作用是相同濃度純化的CL膠團(tuán)的1600倍。Lactadherin還可以減少經(jīng)mtMPs注射小鼠的死亡率。
　

8、　結(jié)論：（1）TBI后損傷的神經(jīng)細(xì)胞釋放mtMPs至外周循環(huán)血中，mtMPs表面含有大量CL（2）表面暴露CL的mtMPs具有高的促凝活性，其可以引起TBI后凝血功能障礙的發(fā)生。（3）微粒清除蛋白Lactadherin可以抑制CL和mtMPs的促凝作用，其還可以減少注射了mtMPs小鼠的死亡率。本研究揭示了一種新的表面暴露CL的mtMPs介導(dǎo)的TBI相關(guān)凝血功能障礙發(fā)生的機(jī)制，并初步探索了一種潛在的抑制這種促凝機(jī)制治療TBI-AC的方法