TGFβR3介導強直性脊柱炎成纖維細胞成骨分化作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種與免疫因素相關的脊柱關節(jié)病變，病因復雜，涉及中軸關節(jié)、軟骨、肌腱和韌帶的改變。其中，脊柱韌帶骨化引起的異位骨形成是AS關鍵病理進程，但韌帶骨化的機制尚不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)AS患者棘上韌帶中轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factorβ1，TGF-β1）、骨形成蛋白2（bone morphogenetic proteins，

2、BMP2）和TGF-β受體3(transforming growthfactor-β receptor3，TGFβR3)表達較對照韌帶明顯升高。
　　提出“TGFβR3過表達介導AS原代成纖維細胞成骨分化”的假設。本研究擬圍繞TGFβR3開展工作，首先明確TGF-β1和BMP2通過過表達的TGFβR3誘導AS原代成纖維細胞成骨分化，然后確認TGFβR3-Smad通路中介導AS成纖維細胞成骨分化的關鍵分子，以初步闡明AS成纖維細胞成

3、骨分化的分子機制，為研究治療AS的靶向藥物或其它治療措施提供候選靶點。
　　方法:
　　一、TGFβR3在AS臨床標本中的表達
　　二、確認TGFβR3介導AS成纖維細胞成骨分化作用
　　（一）AS原代成纖維細胞的成骨分化檢測
　　采用礦化誘導-茜素紅染色法對HSLFs細胞進行鈣化誘導和鈣化結(jié)節(jié)染色，觀察AS來源HSLFs細胞較對照細胞是否產(chǎn)生更多細胞外鈣化結(jié)節(jié);
　?。ǘ㏕GF-β1聯(lián)合BMP2對

4、TGFβR3過表達HSLFs細胞成骨分化的影響;
　?。ㄈ㏕GF-β1聯(lián)合BMP2對TGFβR3低表達的HSLFs細胞成骨分化的影響
　　1.采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染TGFβR3的siRNA到TGFβR3過表達HSLFs細胞中，構(gòu)建TGFβR3低表達HSLFs細胞;
　　2.采用半定量PCR檢測siRNA封閉TGFβR3表達的效率;
　　3.TGF-β1聯(lián)合BMP2對TGFβR3低表達的HSLFs細胞成骨分化的影響;<

5、br>　　三、確認AS成纖維細胞成骨分化中TGFβR3/Smad通路關鍵分子
　?。ㄒ唬㏕GF-β1聯(lián)合BMP2對TGFβR3過表達HSLFs細胞Smad通路的影響:
　　Western blot檢測TGF-β1聯(lián)合BMP2對TGFβR3過表達HSLFs細胞TGFβR1、TGFβR2、TGFβR3、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad1、p-Smad1、Smad4和RUNX2表達的影響;
　?。ǘ㏕GF-β1

6、聯(lián)合BMP2對TGFβR3低表達HSLFs細胞Smad通路的影響:
　　Western blot檢測TGF-β1聯(lián)合BMP2對TGFβR3低表達HSLFs細胞TGFβR1、TGFβR2、TGFβR3、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad1、p-Smad1、Smad4和RUNX2表達的影響;
　　四、確認TGFβR3/Smad通路關鍵分子在AS臨床標本中的表達
　?。ㄒ唬〢S棘上韌帶中p-Smad2/3、p-Sm

7、ad1、Smad4和RUNX2的表達;
　?。ǘ〢S來源HSLFs細胞中p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表達；
　　結(jié)果:
　　一、TGFβR3在AS臨床標本中的表達
　　（一）AS臨床標本的組織病理學鑒定
　　AS患者脊柱和骶髂關節(jié)融合;而AS棘上韌帶組織與正常棘上韌帶相比，纖維束斷裂、排列紊亂、玻璃樣變性，脂肪浸潤和血管增生較多。
　　（二）TGFβR3在AS臨床標本

8、中的表達
　　1.AS棘上韌帶組織TGFβR3、TGF-β1和BMP2蛋白表達均顯著高于正常棘上韌帶組織，其表達多分布于血管周圍、纖維化部位及韌帶外包膜;
　　2.TGFβR3在AS標本中mRNA表達量約為對照組的5～6倍，TGF-β1在AS標本中的mRNA表達量約為對照組的2倍，BMP2在AS標本中的mRNA表達量比對照組高100～150倍;
　?。ㄈ㏕GFβR3在AS原代成纖維細胞中的表達
　　1.成功從A

9、S棘上韌帶和骨折棘上韌帶分離培養(yǎng)獲得原代成纖維細胞(hSLFs);
　　2.AS來源hSLFs細胞中TGF-β1、BMP2及TGFβR3的蛋白表達較普通hSLFs細胞明顯增高，與在棘上韌帶的RNA水平和蛋白水平檢測結(jié)果一致。
　　二、確認TGFβR3介導AS成纖維細胞成骨分化作用
　?。ㄒ唬〢S原代成纖維細胞的成骨分化檢測
　　成骨誘導AS來源HSLFs細胞后細胞外鈣化結(jié)節(jié)較普通HSLFs細胞明顯增多。
　

10、　（二）TGF-β1聯(lián)合BMP2對TGFβR3過表達的HSLFs細胞成骨分化的影響
　　1.pcDNA-TGFβR3質(zhì)粒構(gòu)建成功;
　　2.構(gòu)建的TGFβR3過表達HSLFs細胞的TGFβR3表達顯著高于普通HSLFs細胞;
　　3.TGF-β1聯(lián)合BMP2誘導TGFβR3過表達HSLFs細胞的細胞面積明顯增大;
　　4.TGF-β1聯(lián)合BMP2對TGFβR3過表達HSLFs細胞增殖無明顯影響;
　　5.T

11、GF-β1聯(lián)合BMP2可誘導TGFβR3過表達HSLFs細胞的鈣化結(jié)節(jié)較單用TGF-β1或BMP2明顯增多;
　　（三）TGF-β1聯(lián)合BMP2對TGFβR3低表達的HSLFs細胞成骨分化的影響
　　1.轉(zhuǎn)染TGFβR3 siRNA的HSLFs細胞中TGFβR3表達僅為轉(zhuǎn)染無關siRNA的細胞的30％;
　　2.TGF-β1聯(lián)合BMP2較單用組不能進一步誘導TGFβR3低表達HSLFs細胞肥大;
　　3.TGF-

12、β1聯(lián)合BMP2較單用組不能進一步誘導TGFβR3低表達HSLFs細胞的鈣化結(jié)節(jié);
　　三、確認AS成纖維細胞成骨分化中TGFβR3/Smad通路關鍵分子
　?。ㄒ唬㏕GF-β1聯(lián)合BMP2對TGFβR3過表達HSLFs細胞Smad通路的影響
　　1.TGF-β1聯(lián)合BMP2較單用組顯著上調(diào)TGFβR3表達，但不能進一步上調(diào)TGFβR1和TGFβR2表達;
　　2.TGF-β1聯(lián)合BMP2較單用組顯著上調(diào)Smad

13、2/3和Smad1磷酸化、Smad4和RUNX2表達。
　?。ǘ㏕GF-β1聯(lián)合BMP2對TGFβR3低表達HSLFs細胞Smad通路的影響；
　　四、確認TGFβR3/Smad通路關鍵分子在AS臨床標本中的表達
　　（一）AS棘上韌帶中p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表達
　　AS棘上韌帶組織的p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2蛋白表達較正常棘上韌帶組織顯著

14、上調(diào)，其表達多分布于血管周圍、纖維化部位及韌帶外包膜。
　　（二）AS來源HSLFs細胞中p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表達
　　AS來源HSLFs細胞的p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2蛋白表達較普通HSLFs細胞均明顯增高，與在完整棘上韌帶組織的IHC檢測結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　1.AS棘上韌帶較正常棘上韌帶發(fā)生顯著組織病理改變;
　　2.TGF

15、βR3、TGF-β1和BMP2在AS棘上韌帶組織中的表達較對照組織顯著升高，在AS原代成纖維細胞中的表達較對照細胞也顯著升高;
　　3.AS原代成纖維細胞可自動成骨分化;
　　4.TGF-β1聯(lián)合BMP2可誘導TGFβR3過表達HSLFs細胞成骨分化，二者具有協(xié)同效應;
　　5.封閉TGFβR3表達后，TGF-β1聯(lián)合BMP2誘導HSLFs細胞成骨分化作用喪失，提示TGF-β1協(xié)同BMP2誘導成骨分化作用依賴于TGFβ

16、R3的過表達;
　　6.TGF-β1聯(lián)合BMP2較單用組顯著上調(diào)TGFβR3表達、下游效應分子Smad2/3和Smad1磷酸化、Smad4和RUNX2的表達;
　　7.封閉TGFβR3表達后，TGF-β1聯(lián)合BMP2上調(diào)TGFβR3表達、下游效應分子Smad2/3和Smad1磷酸化、Smad4和RUNX2表達的作用喪失，提示TGF-β1協(xié)同BMP2誘導TGFβR3-Smad通路活化作用依賴于TGFβR3的過表達;
　　

17、8.TGFβR3-Smad通路效應分子p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表達在AS棘上韌帶組織和AS原代成纖維細胞中均顯著升高;
　　9.本研究明確TGF-β1和BMP2經(jīng)由過表達的TGFβR3誘導AS棘上韌帶來源的成纖維細胞成骨分化，其分子機制為通過激活p-Smad2/3和p-Smad1磷酸化、Smad4表達，同時活化TGF-β/Smad和BMP/Smad通路，上調(diào)成骨誘導因子RUNX2表達而發(fā)揮作用。