VD在PC12細胞中對Cer的影響研究及補充VD前后EAE鼠血清中蛋白質組學分析.pdf

1、背景:
　　多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis，MS)是一種伴隨著神經細胞死亡，髓鞘脫落的中樞神經系統(tǒng)自身免疫性疾病，患者常出現幻視及認知障礙等臨床癥狀。MS的發(fā)病機制尚不明確，目前大多數研究者認為MS的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同影響的結果。MS的臨床治療藥物仍停留在免疫調節(jié)劑及免疫抑制劑階段，但均療效有限且存在嚴重的副作用。維生素D（Vitamin D，VD）作為人體內必需的微量有機物質，主要在調節(jié)人體內的鈣穩(wěn)

2、態(tài)方面發(fā)揮重要作用。近年來，VD在免疫系統(tǒng)疾病及癌癥治療方面的作用逐漸受到關注。流行病學調查顯示，MS發(fā)病率與光照有顯著相關性。光照可催化體內VD合成，科學家們推測MS與VD具有相關性。隨后的研究發(fā)現，MS病人體內，維生素D的含量明顯降低，且維生素D的缺乏可增加MS的患病風險。進一步研究發(fā)現，在實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)動物模型實驗中，補充維生素

3、D能顯著緩解模型動物的EAE癥狀。目前關于維生素D緩解MS/EAE的作用研究已有些報道，但其具體作用機制仍不甚明確。因此，深入探討維生素D緩解MS/EAE作用機制，可為維生素D的臨床應用提供必要的實驗依據，具有重要的理論和實踐意義。
　　一，PC12細胞中維生素D對神經酰胺的影響作用研究
　　鞘脂是一類參與到多種生物學功能和病理學過程中的脂類物質。神經酰胺(Ceramide，Cer)作為鞘脂類的中心代謝產物參與多種細胞活動，

4、如細胞遷移，凋亡過程及炎癥反應。短鏈神經酰胺及內源性神經酰胺能夠促進PC12細胞的凋亡，主要表現為促進細胞核的破碎和核內DNA的損傷。近年來的研究發(fā)現在EAE大鼠的脊髓內，C16∶0-Cer的含量顯著升高，神經酰胺合酶6的mRNA表達水平和蛋白表達水平均顯著升高，這表明Cer與EAE/MS的發(fā)生發(fā)展有關。本課題組的前期工作表明，維生素D能顯著降低EAE大鼠脊髓內Cer下游代謝產物鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine1-phospha

5、te，S1P)的含量并緩解EAE大鼠發(fā)病進程，但是作用機制尚不明確。因此，本研究利用PC12細胞，探討維生素D對神經酰胺的影響作用并對其作用機制進行研究，為維生素D緩解MS/EAE的作用機制研究提供細胞水平的實驗依據。
　　目的:
　　闡明在PC12細胞中維生素D對神經酰胺的影響作用。為VD治療MS的機制研究提供細胞水平的實驗依據。
　　方法:
　　1，采用MTT法檢測C2-Cer(20，10，5，2.5，1.2

6、5，0.62，0μM)處理的PC12細胞的細胞活性。
　　2，采用HPLC-MS的方法檢測維生素D（50nM和0nM）處理的PC12細胞中C16∶0-Cer的含量。
　　3，采用RT-PCR法檢測維生素D（50nM和0nM）處理的PC12細胞中神經酰胺合成和代謝相關酶的含量。其中包括存在于脊髓中的神經酰胺合成相關酶，SPT(SPTLC1，SPTLC2)，Cers(Cers1，Cers2，Cers3，Cers5，Cers6)，

7、以及神經酰胺的代謝相關酶Cerk，Smpd1-3，Sgsm1，Asah，Gba，Sms。
　　4，采用Western Blot法檢測維生素D(200，100，50，25，12.5，0 nM)處理的PC12細胞中SPTLC1和Cers6的蛋白表達水平。
　　結果:
　　1，隨神經酰胺(C2-Cer)刺激濃度增加PC12細胞的存活率逐漸下降，并表現出劑量依賴性(P***＜0.05）。
　　2，在50nM維生素D刺激后

8、的PC12的中C16∶0-Cer的含量顯著低0nM維生素D刺激后的PC12細胞(P*＜0.05)。說明維生素D具有降低C16∶0-Cer的含量的作用。
　　3，在50nM維生素D刺激后的PC12細胞中絲氨酸棕櫚酰轉移酶1(SPTLC1)的mRNA表達水平顯著高于0nM維生素D刺激后的PC12細胞（P***＜0.05）。CerS6的mRNA表達水平同樣顯著高于0nM維生素D刺激的PC12細胞（P***＜0.05）。
　　4，在

9、維生素D刺激后的PC12細胞中SPTLC1的蛋白表達隨著維生素D濃度的升高顯著降低，當維生素D濃度為50nM時SPTLC1的相對蛋白表達量達到最低水平（P***＜0.05）。而Cers6的蛋白表達水平顯著升高，當維生素D濃度為200nM時Cers6的相對蛋白表達量達到最高（P***＜0.05）。
　　結論:
　　維生素D可能通過降低神經酰胺的從頭合成的限速酶SPTLC1的蛋白表達水平來降低細胞內C16∶0-Cer的含量，從而

10、降低神經酰胺對PC12細胞凋亡的促進作用。因此，我們推測，在MS中，維生素D也可能通過降低神經酰胺的促神經細胞凋亡的作用，起到緩解MS的效果，為維生素D治療MS的機制研究提供了新思路。
　　二，基于iTRAQ技術篩選補充維生素D前后EAE大鼠血清中的差異蛋白
　　相對和絕對定量同位素標記(iTRAQ)是一種基于等重同位素標記的相對和絕對定量技術，是近年來發(fā)展迅速的定量蛋白質組學高通量篩選技術。
　　目的:
　　應

11、用iTRAQ技術，篩選誘導EAE前后及補充維生素D與未補充維生素D的EAE大鼠血清中表達差異的蛋白，篩選與EAE發(fā)病相關的血清標志物，同時，為維生素D治療MS/EAE機制提供新思路。
　　方法:
　　制備EAE大鼠模型，并收集血清。采用iTRAQ技術對正常（C組），EAE發(fā)病組(EAE)和補充維生素D的EAE發(fā)病組(VE)大鼠血清進行蛋白質組學分析。
　　1，構建EAE大鼠模型和補充維生素D:取18只大鼠平均分為三組，

12、正常組（C組，6只），發(fā)病組（EAE組，6只），補充維生素D發(fā)病組（VE組，6只）。誘導EAE大鼠模型，應用等體積完全弗氏佐劑（CFA，含5mg/ml的百日咳疫苗）和堿性髓鞘蛋白溶液(MBP,1 mg/ml)混合液注射Lewis大鼠雙側足墊，自免疫之日起，記錄大鼠體重及評分情況。免疫發(fā)病后，處死大鼠，取大鼠心臟全血，離心取血清。
　　2，iTRAQ篩選EAE誘導前后及維生素D補充前后大鼠血清中差異表達的蛋白:每組中每三只大鼠血清混

13、合為一個樣品池，去除血清中高豐度蛋白后定量，酶解獲得肽段。利用同位素標記肽段，SCX分級隨后進行梯度Q-exactive分析，共計15次LC-MS/MS分析。得到原始質譜數據后通過Proteome Discoverer分析軟件檢索數據庫獲得差異表達蛋白。
　　3，篩選C組與E組大鼠血清中表達差異的蛋白及VE組與E組大鼠血清中表達差異的蛋白。
　　4，通過GO功能注釋和KEGG通路分析等生物信息學方法分析差異蛋白的功能屬性及作

14、用通路。
　　結果:
　　1，成功構建EAE大鼠模型。
　　2，按照P-value小于0.05且表達差異倍數大于1.2倍的標準，篩選差異表達的蛋白。E組與C組相比，篩選出74種具有差異表達的蛋白，其中上調的蛋白42種，下調的蛋白32種;VE組與E組相比，篩選出80種差異表達的蛋白，其中上調蛋白40種，下調蛋白40種。其中E/C和VE/E中表達均變化的蛋白有20種。
　　3，生物信息學分析表達差異蛋白的功能及作用通

15、路。
　　4，選擇Proterin S100-A8和Interleukin1 receptor antagonist作為候選蛋白。它們不僅與EAE的發(fā)病相關而且能在維生素D的作用時下調。
　　結論:
　　本實驗首次將定量蛋白質組學技術應用于EAE鼠血清中篩選差異表達的蛋白。我們篩選出了74種在EAE鼠與正常鼠血清中的表達差異的蛋白，為EAE發(fā)病機制的研究提供了精確定量組學數據;我們還篩選出了80種補充VD的EAE大鼠與