左旋聚乳酸定向納米纖維影響PC12細胞分化的蛋白質組學研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)是人體內起主導作用的功能調節(jié)系統(tǒng)，但神經(jīng)系統(tǒng)再生能力有限。隨著神經(jīng)組織工程技術的發(fā)展，利用神經(jīng)組織工程技術制作的各種支架，為神經(jīng)損傷修復創(chuàng)造了有利條件。納米纖維具有較大的孔隙率，可以模擬胞外基質形貌，尤其是定向納米纖維能引導神經(jīng)細胞的神經(jīng)突觸伸展，促進神經(jīng)細胞分化，使得定向納米纖維成為神經(jīng)組織工程的一種良好的支架材料。蛋白質是生物體行使其功能的基本單位，細胞內的基因通過轉錄、翻譯、修飾產生蛋白質后，才能最終行使相關功能。因此蛋白

2、質組學的研究能更好地幫助人們了解機體內各項生理功能的產生機制。對于定向納米纖維影響神經(jīng)細胞分化的分子機理研究，目前主要是采用傳統(tǒng)的分子生物學技術來研究，發(fā)現(xiàn)了單個或少量發(fā)揮重要作用的蛋白質，然而在蛋白質組學水平系統(tǒng)性分析定向納米纖維對神經(jīng)細胞的蛋白質譜影響的研究至今仍未見報道。
　　本論文的目的是綜合運用蛋白質組學技術和生物信息學方法，研究左旋聚乳酸(PLLA)不定向/定向納米纖維對PC12細胞內蛋白質表達的影響，最終在蛋白質層次

3、揭示PLLA定向納米纖維對PC12細胞的影響。隨后與本課題組前期的研究結果(mRNA表達譜和microRNA表達譜)進行聯(lián)合分析，從mRNA-microRNA-蛋白質角度闡釋PLLA定向納米纖維影響PC12細胞分化的分子機理。最后，將本論文的聯(lián)合分析結果與本課題組其他研究的聯(lián)合分析結果進行類比分析，探究microRNA在生物材料影響細胞行為過程中的作用機制。此外，本論文還采用人工合成的GRGDS五肽對整聯(lián)蛋白在PLLA定向納米纖維影響P

4、C12細胞分化的介導作用進行干擾，研究整聯(lián)蛋白的介導機理。
　　本論文的具體工作如下:
　　1、采用靜電紡絲法制備左旋聚乳酸(PLLA)不定向/定向納米纖維，采用勻膠法制備PLLA薄膜。對三種材料進行了紅外光譜分析、掃描電子顯微鏡(SEM)觀察、接觸角測定和力學性能測試的表征。結果表明，三種實驗材料化學組成性質一致，均為PLLA;PLLA薄膜表面比較平滑，不定向/定向納米纖維粗細均一且無串珠，直徑分別為238.20±4.88

5、nm和269.30±4.27nm，定向納米纖維具有較好的取向性;經(jīng)過處理后，三種材料的親水性均逐步提升，有利于細胞的粘附;PLLA定向納米纖維的彈性模量(1214.48±58.47MPa)遠高于PLLA不定向納米纖維的彈性模量(99.15±41.44MPa)，提高取向性后PLLA納米纖維的韌性增強。
　　2、將預分化48h的PC12細胞分別種植在PLLA薄膜（Control組）、PLLA不定向納米纖維（RF組）和PLLA定向納米纖

6、維(AF組)上，隨后對細胞進行細胞活力測定和細胞形貌（吖啶橙染色和掃描電鏡）觀察，并采用高內涵分析系統(tǒng)(HCS)測定三組材料表面的PC12細胞的突觸長度。實驗結果表明，和陰性對照組的細胞相比，三組材料表面的細胞活力在90％以上，表明細胞活力狀況良好;PC12細胞在薄膜表面基本呈圓形，在兩種納米纖維表面則伸出突觸，但在不定向納米纖維表面其突觸較短且向不同方向伸展，在定向納米纖維表面的PC12細胞的突觸長度沿纖維取向向外伸展，且長度明顯大于

7、Control組和RF組;HCS測定結果表明PLLA定向納米纖維表面生長的單個細胞所含突觸總長度平均值顯著大于PLLA不定向納米纖維組和PLLA薄膜組。以上結果說明PLLA定向納米纖維更有利于PC12細胞的分化。
　　3、采用基于iTRAQ標記的定量蛋白質組學鑒定技術分別鑒定了預分化48h的PC12細胞接種于三種實驗材料表面24h后細胞內的蛋白質表達信息，計算了每種蛋白質的相對豐度，并進一步分析了生長在PLLA不定向/定向納米纖維

8、表面的PC12細胞內蛋白質表達情況的差異。結果表明，相對于Control組，RF組和AF組分別有235和281種蛋白質發(fā)生差異表達。
　　4、采用生物信息學方法對差異表達蛋白質進行了聚類分析、GO功能分析和生物學通路分析。結果顯示，RF組中3個上調表達蛋白質涉及1個分化相關GO功能，4個下調表達蛋白質涉及2個分化相關GO功能;AF組14個上調表達蛋白質涉及3個分化相關GO功能。RF組和AF組差異表達蛋白質分別涉及8個和11個分化相

9、關生物學通路。相對于RF組，AF組的分化相關差異表達蛋白質數(shù)量更多，且涉及的分化相關生物學通路更多。本論文通過Western Blot和乙酰膽堿檢測實驗對蛋白質組學鑒定和生物信息學分析結果進行了驗證。
　　5、對所得的蛋白質組學實驗數(shù)據(jù)和小組前期得到的mRNA和microRNA表達譜芯片實驗數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析。結果表明，PLLA不定向納米纖維組發(fā)生差異表達的mRNA、miRNA和蛋白質組學數(shù)據(jù)無匹配部分，而PLLA定向納米纖維可能通

10、過miR-24、miR-25、miR-92a、miR-19b、miR-183、miR-29a、miR-29c、miR-23b調控Dnajb12、Rhob、Wbp11、Hmgcs1、Hmgn2基因的表達，進而調控粘著斑信號通路和細胞骨架、基因表達、轉運、加工合成、代謝、發(fā)育、應激等GO功能。最后，將本論文的聯(lián)合分析結果與本課題組其他研究的聯(lián)合分析結果進行類比分析，結果表明細胞內蛋白質的表達是由多個microRNA綜合作用的結果，而且在此過

11、程中有其他調控機制也發(fā)揮作用。
　　6、通過基于iTRAQ標記的定量蛋白質組學鑒定技術，發(fā)現(xiàn)種植在PLLA定向納米纖維上的PC12細胞的整聯(lián)蛋白受到GRGDS五肽干擾后，有250個蛋白質發(fā)生了差異表達，并且大部分與細胞分化相關的生物學通路發(fā)生了改變，表明整聯(lián)蛋白對于PLLA定向納米纖維誘導PC12細胞分化的過程中發(fā)揮了重要作用。再結合課題組前期mRNA表達譜和micorRNA表達譜技術聯(lián)合分析了胞內mRNA、miRNA和蛋白質的表