在魚藤酮處理的PC12細(xì)胞中研究白果內(nèi)酯對α-共核蛋白的影響.pdf

1、一.研究背景
　　 帕金森病(Parkinson Disease,PD)足一種中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床表現(xiàn)主要包括肌強(qiáng)直、運(yùn)動障礙、靜止震顫、姿勢障礙等。主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性、死亡，同時伴殘存神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)路易小體(Lewy's body)。目前常用的抗帕金森藥物如左旋多巴、多巴胺受體激動劑等并不能阻止或減緩PD的病程，因而對多巴胺能神經(jīng)元有神經(jīng)保護(hù)作用的抗帕金森病藥物成了研究的熱點(diǎn)

2、。白果內(nèi)酯(bilobalide)——銀杏葉提取物(extracts of Ginkgo biloba leaves，EGbs)中的主要成份，便是具有神經(jīng)保護(hù)作用潛能的藥物之一。
　　 大量動物實(shí)驗(yàn)表明EGbs能減少海馬區(qū)神經(jīng)元的死亡，改善癡呆癥狀，并有至少四項(xiàng)隨機(jī)雙盲試驗(yàn)表明它能減輕阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)和血管性因素引起的癡呆。目前，EGbs是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最多的治療癡呆的藥物之一。白果內(nèi)酯作

3、為EGbs的主要有效成份，動物和離體實(shí)驗(yàn)證明它具有EGbs的幾乎所有特性，包括保護(hù)線粒體功能、抗氧化應(yīng)激、清除氧自由基、抗細(xì)胞水腫、抑制β-淀粉樣蛋白的聚集和毒性等。
　　 PD同樣是最常見于老年人的神經(jīng)退行性疾病之一，它和AD在發(fā)病機(jī)制，病理過程等方面均極相似。首先，兩者都涉及蛋白質(zhì)的異常折疊和沉積，在PD為α-共核蛋白(α-synuclein protein)和路易氏小體，在AD為β-淀粉樣蛋白；兩者均有大量神經(jīng)元的非炎癥性

4、死亡，包括凋亡；兩者均與氧化應(yīng)激及氧自由基損傷、興奮性氨基酸毒性、N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體分布異常，溶酶體功能缺陷等密切相關(guān)。人們發(fā)現(xiàn)一些對AD有治療作用的藥物對例如NMDA受體拮抗劑美金剛(Memantine)和利福平對PD患者亦同樣有效，也說明了兩種疾病之間共享某些發(fā)病的機(jī)制。
　　 AD和PD之間的相似性讓人猜測白果內(nèi)酯對PD和多巴胺能神經(jīng)元也有保護(hù)作用。這一猜測已經(jīng)

5、得到了初步證實(shí)：動物實(shí)驗(yàn)表明，白果內(nèi)酯能明顯縮短大鼠由于腹腔注射毒扁豆堿所引起的震顫持續(xù)時間，同樣，可明顯減輕由微量6-羥多巴胺(6-OHDA)單側(cè)黑質(zhì)注射引起的PD大鼠模型的旋轉(zhuǎn)。體外實(shí)驗(yàn)示它對一氧化氮(NO)、6-OHDA、1-甲基-4-苯基-吡啶鹽(1-methyl-4-phenyl-pyridinium，MPP+)、魚酮藤所致的細(xì)胞損害有保護(hù)作用，可能的機(jī)制包括有減輕保護(hù)線粒體功能、抗氧化應(yīng)激、抗興奮性毒性、抑制凋亡等。另外，白

6、果內(nèi)酯對β-淀粉樣蛋白所致的PC12細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用，提示其可能對蛋白質(zhì)異常折疊及聚集有干預(yù)作用。a-Synuclein蛋白的過量或異常表達(dá)被認(rèn)為是PD最重要的發(fā)病機(jī)制之一，但是白果內(nèi)酯對a-Synuclein蛋白表達(dá)的影響尚未見報道。本課題在已有的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上觀察白果內(nèi)酯對a-Synuclein蛋白轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探索白果內(nèi)酯的可能的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。
　　 為了探討白果內(nèi)酯對PC12細(xì)胞的影響及可能的機(jī)制，我們選

7、擇魚酮藤構(gòu)建PD的細(xì)胞模型。用魚藤酮制作PD動物模型及細(xì)胞模型的技術(shù)目前已比較成熟，與1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2，3,6-tetrahydropyridine，MPTP)一樣，魚藤酮是一種高親和力的經(jīng)典的線粒體復(fù)合物Ⅰ抑制劑，能引起神經(jīng)元尤其是多巴胺能神經(jīng)元的損傷和死亡，并產(chǎn)生在病理表現(xiàn)、臨床癥狀上都極類似于人類PD疾病的動物模型。除了線粒體功能障礙、ATP合成減少、脂質(zhì)過氧

8、化和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的過度生成外，魚藤酮尚可干擾細(xì)胞內(nèi)的微管系統(tǒng)，并增加α-synuclein蛋白的異常折疊和聚集，在免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色中可觀察到類圓形α-synuclein染色陽性的包涵體形成。本課題欲研究白果內(nèi)酯對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，重點(diǎn)觀察是否與氧化應(yīng)激及α-synuclein蛋白的表達(dá)和聚集相關(guān)，故選用魚藤酮構(gòu)建細(xì)胞模型是合理的選擇。
　　 二.研究目的

9、　　 1.建立魚藤酮誘導(dǎo)的α-synuclein過量表達(dá)的PD細(xì)胞模型。
　　 2.明確白果內(nèi)酯對魚藤酮處理的PC12細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。
　　 3.進(jìn)一步了解白果內(nèi)酯對α-synuclein蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)是否有影響。
　　 4.結(jié)合已有的實(shí)驗(yàn)成果，探討PD發(fā)病機(jī)制中氧化應(yīng)激和α-synuclein蛋白的關(guān)系，以及白果內(nèi)酯發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制，為其用于PD的臨床治療提供依據(jù)。
　　 三.實(shí)驗(yàn)步驟和

10、方法
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：PC12細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株細(xì)胞)經(jīng)100ng/ml7S神經(jīng)生長因子處理9天成分化細(xì)胞后培養(yǎng)于含有10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，并5％CO2的37℃培養(yǎng)箱孵育，隔天更換培養(yǎng)基。根據(jù)不同的處理?xiàng)l件分成4組：對照組(常規(guī)加培養(yǎng)基)、魚藤酮組、魚藤酮+白果內(nèi)酯(低，高劑量)預(yù)處理組。
　　 2.確定細(xì)胞模型建立方法。在正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞中加入不同濃度梯度的魚藤酮(50

11、nmol/L-3.2μmol/L)，作用24h后，用MTT法檢測細(xì)胞活性，根據(jù)結(jié)果確定魚藤酮的作用濃度。
　　 3.確定白果內(nèi)酯的作用濃度。在正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞中加入不同濃度梯度的白果內(nèi)酯，2小時后根據(jù)前一步驟的結(jié)果，加入一定濃度的魚藤酮，作用24h后以MTT試驗(yàn)的結(jié)果選取用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的白果內(nèi)酯的低、高劑量濃度。
　　 4.明確白果內(nèi)酯對魚藤酮處理的分化PC12細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。根據(jù)上述分組施以不同的處理并檢測以

12、下指標(biāo)：(1)MTT法檢測細(xì)胞活性；(2)普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；(3)熒光顯微鏡觀察Hoechst33342核染色情況；(4)annexin V-FITC/PI染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
　　 5.用RT-PCR方法和Western-Blotting方法檢測各組細(xì)胞α-synuclein mRNA和α-synuclein蛋白的量。
　　 6.統(tǒng)計分析：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件

13、，采用單因素方差分析，處理組間的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 四.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.1.6μmol/L魚藤酮作用24h能顯著減低分化PC12細(xì)胞的細(xì)胞活性，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹變圓、崩解、軸突消失、細(xì)胞數(shù)量減少；MTT試驗(yàn)結(jié)果示魚藤酮組細(xì)胞存活率顯著下降(71.51％±2.83％)，10μmol/L及50μmol/L白果內(nèi)酯組存活率分別為(80.73％±2.46％)、(87.58％±3.21

14、％)、均顯著高于魚藤酮組(P＜0.01)，并能減輕魚藤酮引起的形態(tài)學(xué)改變。
　　 2.1.6μmol/L魚藤酮作用24h引起PC12細(xì)胞凋亡增多，在Hoechst33342細(xì)胞核染色圖片中表現(xiàn)為胞核邊緣粗糙、核固縮、熒光增強(qiáng)，有的可見核碎片。Annexin V-FITC/PI染色，流式細(xì)胞儀檢測示魚藤酮組細(xì)胞凋亡率為15.2±1.8％，較control組顯著增加，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；低、高劑量白果內(nèi)酯組(10、50μm

15、ol/L)凋亡率分別為9.3±1.4％，10.1±0.8％，兩者間無統(tǒng)計學(xué)差異，但均顯著低于魚藤酮組(P＜0.05)。
　　 3.Western-blotting結(jié)果示：魚藤酮組α-synuclein蛋白的表達(dá)顯著大于對照組，接近正常細(xì)胞的三倍，(P＜0.01)。低、高劑量白果內(nèi)酯組α-synuclein蛋白的表達(dá)量顯著低于魚藤酮組(P＜0.01)，但仍高于正常對照組。
　　 4.RT-PCR結(jié)果示：魚藤酮組α-synu

16、clein mRNA的量顯著大于對照組(P＜0.05)；低、高劑量白果內(nèi)酯α-synuclein蛋白的表達(dá)量顯著低于魚藤酮組(P＜0.01)，接近對照組水平。
　　 五.實(shí)驗(yàn)結(jié)論
　　 1.魚藤酮可誘導(dǎo)出α-synuclein蛋白高表達(dá)的帕金森病細(xì)胞模型。
　　 2.白果內(nèi)酯能同時減輕魚藤酮引起的PC12細(xì)胞的壞死和凋亡，對分化PC12細(xì)胞有保護(hù)作用。
　　 3.白果內(nèi)酯能抑制α-synuclein蛋白的