鴨瘟病毒US2蛋白特性分析及小RNA干擾對US2基因功能影響初探.pdf

1、關于鴨瘟病毒(Duck Plague Virus，DPV) US2基因的研究很少，本論文將本實驗注冊的DPV-CHv株US2基因(GenBank Accession:EU195086)進行了生物信息學分析，開展原核表達、US2蛋白純化、兔抗蛋白抗體的制備等，然后分別通過實時熒光定量PCR和Western Blot來檢測US2基因在DPV感染鴨胚成纖維細胞過程中轉錄水平的變化以及表達動力學過程。為了更清晰地揭示US2蛋白在細胞中的動態(tài)過程

2、，我們采用了間接熒光免疫方法來檢測US2的定位，同時通過病毒蛋白酶K實驗鑒定了US2蛋白屬性。為了驗證US2基因是否有抗原遞呈功能，用小RNA干擾載體來干擾US2基因的功能，然后用MHC ELISA試劑盒來檢測US2基因干擾前后的MHC水平的變化。
　　1.鴨瘟病毒US2基因的克隆、原核表達以及多抗的制備對鴨瘟病毒US2基因進行序列分析、克隆及原核表達，并利用獲得的His重組蛋白分別制備了兔抗US2-IgG多克隆抗體，抗體瓊擴效價

3、為1∶16。
　　2.鴨瘟病毒感染鴨胚成纖維細胞(DEF)后US2基因mRNA轉錄水平、表達動力學及細胞定位分析采用實時熒光定量PCR技術對DPV感染DEF不同時期US2 mRNA的水平變化進行熒光定量分析;并提取不同感染時期細胞蛋白，利用蛋白免疫印跡法檢測US2蛋白在DEF中的表達水平變化。熒光定量結果表明:DPV感染DEF24h至72h，US2基因轉錄水平持續(xù)上升，84h至96h US2 mRNA含量急劇下降，與對照組的轉錄水

4、平相比，有明顯差異。免疫印跡結果表明，DEF感染DPV從48h開始能明顯檢測到US2蛋白。間接熒光免疫實驗顯示DEF感染DPV從39h-50h，蛋白主要集中在細胞膜上，而且越來越多;從60h開始集中在細胞質和細胞核周圍，到了84h時，蛋白在細胞質中明顯增多。
　　3.利用小RNA干擾US2基因的表達，檢測到被DPV感染的DEF細胞表面MHC的表達量有所減少針對US2ORF的不同靶區(qū)，我們設計并合成4個shRNA載體以確保靶基因被有

5、效抑制。目的是篩選出有效的干擾shRNA來干擾DPV US2基因轉錄，為研究DPV US2基因的功能提供基礎。用熒光定量技術篩選出能有效干擾US2基因轉錄的RNA載體，然后干擾US2轉錄表達，用MHC ELISA試劑盒檢測到DEF細胞表面上的MHC的表達量有顯著增加，該實驗可以推斷DPV US2基因對DEF細胞表面的MHC抗原遞呈分子的表達有抑制作用。
　　4.用濃縮純化的病毒顆粒進行病毒蛋白酶K實驗證實了US2蛋白是皮層蛋白研究

6、鴨瘟病毒US2基因表達產物是否屬于結構蛋白，屬于哪種結構蛋白，對探索其基因編碼蛋白的功能、病毒的轉染、出芽、釋放等具有重要的意義。目前文獻中提到US2蛋白在皰疹病毒中屬于外膜或者皮層蛋白，但是對DPV的US2蛋白是哪種蛋白并沒有作探究。該實驗利用高濃度蔗糖溶液來濃縮病毒粒子，然后分別用去垢劑SDS和蛋白酶K分別來溶解DPV的外膜脂溶性蛋白和其他蛋白成分，同時用已經明確是皮層蛋白的UL51蛋白作為對照，實驗結果證明了US2蛋白在DPV中是