植物GST、DCL基因和泛素-蛋白酶體途徑對植物抗性的調(diào)控功能分析.pdf

1、植物抗病性是一個極其復雜的過程。植物抗性調(diào)控基因的克隆和功能分析有利于深入了解植物抗病性的分子機理。本研究克隆了一批分別編碼本氏煙(Nicotiana benthamiana)谷胱甘肽轉移酶(glutathione S-transferase，GST)和泛素羧基端水解酶(ubiquitin carboxy-terminal hydrolases，UCH)、三生煙和本氏煙DCL(Dicer-like)的基因，并利用突變體、RNAi植株，采

2、用病毒誘導的基因沉默(virusinduced gene silencing，VIGS)技術分析了這些基因的植物抗性調(diào)控功能，獲得了以下主要研究結果：
　　 (1)本氏煙GST基因克隆和植物GST基因功能分析。
　　 采用RT-PCR方法克隆獲得六個本氏煙GST基因片段——NbGST1，NbGST2，NbGST3，NbGST6，NbGST8，NbGST11。其中NbGST3的引物擴增得到2條序列，分別稱為NbGST3a和

3、NbGST3b，可能是NbGST3序列的可變剪接產(chǎn)物。這六個基因分屬于不同GST類別：NbGST1，2，6屬于tau(U)類，NbGST3屬于Theta(T)類，而NbGST8和NbGST11可能屬于Lambda(L)類。它們對環(huán)境因子和生物因子處理具有復雜的響應，大多數(shù)處理因子誘導NbGST1但抑制NbGST8的表達。
　　 采用VIGS技術分析了NbGST基因對植物抗病和抗逆性的調(diào)控功能。發(fā)現(xiàn)NbGST1、NbGST11和N

4、bGST2沉默植株產(chǎn)生的Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介導產(chǎn)生的過敏性反應(hypersensitive response，HR)癥狀比對照顯著減輕甚至完全喪失。NbGST1，3，8沉默植株產(chǎn)生的水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)誘導的HR癥狀比對照顯著減輕。PEG模擬干旱脅迫處理后，NbGST6,8,11沉默植株比對照植株更早和更重的干旱萎蔫癥狀。高鹽脅迫下，NbGST6，8，1

5、1沉默植株的葉片的葉綠素降解比對照明顯增強。表明NbGSTl，2，11可能對Cf-4和Cf-9介導的HR、NbGSTl，3，8可能對Xoo介導的HR、而NbGST6，8，11可能對植物抗旱和耐鹽分別起重要正向調(diào)控作用。NbGST2，11沉默植株葉片的H2O2積累水平顯著上升，表明NbGST2，11可能通過調(diào)節(jié)H2O2積累來調(diào)控植物抗病和抗逆性。
　　 利用擬南芥突變體和RNAi植株分析了擬南芥GST基因AtGSTF10的抗病調(diào)控

6、功能。與野生型對照植株相比，AtGSTF10基因的RNAi植株在分別接種Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000(Pst DC3000)和Sclerotinia sclerotiorum(Ss)后更早產(chǎn)生并表現(xiàn)更嚴重的病害癥狀，表明AtGSTF10基因參與植物對PstDC3000和Ss的抗病調(diào)控。bak1擬南芥突變體和以該突變體為背景的AtGSTF10RNAi植株(RNAi-AtGSTF10/bak1)

7、的發(fā)病情況相似，均比以野生型Col-0為背景的AtGSTF10 RNAi植株(RNAi-AtGSTF10/Col-0)植株表現(xiàn)更為強烈，再考慮到AtGSTF10與BAKl直接結合的前人研究結果，表明BAKl是重要的抗病調(diào)控因子，通過與BAKl的互作是AtGSTF10調(diào)控植物抗病性的重要但不是唯一的途徑。
　　 這些研究結果表明，GST基因是植物抗性的重要調(diào)控因子。
　　 (2)煙草DCL基因克隆及其功能分析。
　　

8、 采用RT-PCR和RACE技術分別克隆獲得了三生煙(Nicotiana tabacum cv.Samsun)和本氏煙的四種DCL基因3'端序列。初步預測本氏煙有5個DCL基因——NbDCL1，NbDCL2，NbDCL3a，NbDCL3b，NbDCL4，而三生煙只有4個DCL基因——NtDCL1，NtDCL2，NtDCL3，NtDCL4。序列分析結果表明，兩種煙草的DCL序列一致率高達93％以上。煙草DCL基因與楊樹的親緣關系較近。預

9、測的DCL蛋白含兩個RNaseⅢ結構域。
　　 煙草DCL基因表達具有明顯的組織特異性，在葉、莖、根中表達水平高，而在花器中表達水平低。煙草DCL基因對不同生物和非生物因子處理產(chǎn)生不同響應。煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)病毒接種強烈誘導NbDCL1-4的基因表達，Ss誘導NbDCL1的基因表達，干旱脅迫處理幾乎不影響NbDCL1-4基因的表達，SA，BTH，JA等防衛(wèi)調(diào)控信號物質(zhì)明顯抑制大多數(shù)D

10、CL基因的表達。
　　 采用VIGS技術分析了煙草DCL基因對植物發(fā)育和抗病性的調(diào)控功能。NbDCL1，2，4影響本氏煙的生長發(fā)育，其中NbDCL1，2作用尤為明顯。NbDCL1的沉默強烈抑制植物的生長發(fā)育，導致植株矮小，葉片畸形(細長無葉肉，內(nèi)卷等)，根系不發(fā)達，花器變小，無花萼或花萼細長。NbDCL2的沉默導致植株矮小，但是無明顯的畸形現(xiàn)象出現(xiàn)。此外，NbDCL1，2，4沉默植株增強了本氏煙對煙草黑脛病菌(Phytophth

11、ora parasitica var. nicotianae，Ppn)侵染的抗性。表明NbDCL1，2，4可能負調(diào)控植物的抗病性。
　　 (3)26S蛋白酶體和NbUCH基因對植物抗病性的調(diào)控功能分析。
　　 利用26S蛋白酶體抑制子MG132對26S蛋白酶體的植物抗病性調(diào)控功能進行了藥理學分析。以MG132處理葉片導致Xoo介導的HR顯著加快加強，但不影響Ss和煙草野火病菌(Pseudomonas syringae p

12、v.tabaci，Pst)對植株的侵染。說明26S蛋白酶體對植物對Xoo的非寄主抗性起重要調(diào)控作用。
　　 通過RT-PCR克隆了一個本氏煙泛素羧基端水解酶基因NbUCH。表達分析研究結果顯示，多種生物和非生物因子脅迫處理均不改變NbUCH基因的表達。采用VIGS技術分析了該基因對植物抗病性的調(diào)控功能。NbUCH基因的沉默導致植物矮小，葉片畸形，表明其可能參與植物的生長發(fā)育的調(diào)控。與對照相比，NbUCH基因的沉默植株產(chǎn)生更弱的X