基于細胞微陣列篩選泛素—蛋白酶體通路底物的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本研究借鑒并優(yōu)化了細胞微陣列技術,結(jié)合綠色熒光蛋白質(zhì)GFP標簽、激光掃描共聚焦顯微鏡以及反式轉(zhuǎn)染技術,建立了包含112個帶GFP標簽的cDNA表達載體的蛋白質(zhì)定位微陣列,根據(jù)泛素-蛋白酶體抑制劑作用后,細胞內(nèi)形成的特征性“點”狀結(jié)構(gòu),實現(xiàn)對泛素化蛋白質(zhì)的快速篩選。我們發(fā)現(xiàn),有40個蛋白質(zhì)在泛素-蛋白酶體抑制劑MG-132處理后形成了聚集點。更重要的是,其中24個蛋白質(zhì),如:MAPKAPK3,NLK和RhoG12等,從未見有與泛素-蛋白酶

2、體相關的文獻報道,而這些蛋白質(zhì)所對應的內(nèi)源蛋白質(zhì)同樣在MG-132處理后形成了類似的“點”狀結(jié)構(gòu)。Western blot分析表明67%出現(xiàn)聚集點的蛋白質(zhì)表達量上調(diào),內(nèi)外源免疫沉淀實驗則證實這些聚集的蛋白質(zhì)發(fā)生了泛素化修飾。TNF-α激活NF-κB通路中主要元件的驗證篩選,表明該篩選體系特異識別48位多泛素化鏈修飾的蛋白質(zhì)。 隨著通量化克隆構(gòu)建技術的出現(xiàn)及自動化圖像采集分析技術的日漸成熟,進一步研究有可能建立一個基于活細胞體內(nèi)分

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