成人手足口病相關腸道病毒非中和抗體反應的初步研究.pdf

1、腸道病毒(enterovirus，EV)是自然界中普遍存在的一類病毒，至今已發(fā)現(xiàn)200多個血清型和基因型，可引發(fā)多種疾病，包括常見的由EV71和CA16感染引起的手足口病(hand，foot，and mouth disease，HFMD)。目前中和抗體檢測是對腸道病毒血清學檢測的有效途徑，對于以交叉表位為核心的非中和抗體反應的研究尤其是腸道病毒的ELISA檢測方面尚未形成有價值的研究成果。
　　本研究首次應用非中和抗體檢測的方法，

2、探究到正常人群血清中腸道病毒A種(CA5、CA10、CA6、CA16、EV71)，對照組腸道病毒B種(CB3)和C種(PV1)幾種病毒VP1的非中和抗體水平及其動態(tài)變化，提高了對腸道病毒感染的普遍性的認識，對建立基于ELISA和競爭ELISA的腸道病毒流行病學監(jiān)測方法有重要意義。
　　（一）腸道病毒VP1序列的全基因合成及原核表達
　　全基因合成了PVI和HAV衣殼蛋白VP1的DNA序列，構建pET-32a-PV1 VP1和

3、pET-32a-HAV VP1原核表達載體。另選取本實驗室已制備好的pET-32a-EV71 VP1，pET-32a-CA16 VP1,pET-32a-CA5 VP1,pET-32a-CA6 VP1,pET-32a-CB3 VP1原核表達載體，原核表達并用鎳柱親和層析的方法純化上述七種重組蛋白;經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定，獲得了純度較高的EV71，CA16，CA5，CA6，CB3，PV1和HAV VP1的重組蛋白。

4、
　?。ǘ┥虾＋I血員腸道病毒VP1非中和抗體反應的檢測和分析
　　以本實驗室自主研發(fā)的新型免疫球蛋白結合分子(Novel Evolved Immunoglobulin(Ig)-Binding Molecule，NEIBM)LD5作為二抗，應用NEIBM-ELISA方法，分別檢測了腸道病毒A種的EV71，CA16，CA5，CA6，腸道病毒B種的CB3，腸道病毒C種的PV1及嗜肝病毒屬的HAV等七種腸道病毒VP1在2013年8

5、月和2014年5月收集的上海市正常獻血員血清中的非中和抗體反應水平，并對48份高反應血清進行了競爭ELISA檢測。通過對抗體反應水平、抗體反應相關系數(shù)、競爭抑制水平和競爭抑制的相關系數(shù)等指標的綜合分析發(fā)現(xiàn)，上海正常人群血清中普遍存在腸道病毒的非中和反應抗體;不同病毒的抗體反應強度不同，抗CB3 VP1非中和抗體反應最強，抗PV1 VP1次之，抗腸道病毒A種VP1反應較弱，抗HAV VP1抗體反應最弱;不同病毒VP1非中和抗體反應的相關系

6、數(shù)與氨基酸序列的同源性水平成正比;EV71VP1與腸道病毒A種的其他成員的非中和抗體反應特點不同;不同時間，腸道病毒的非中和抗體反應出現(xiàn)明顯差異。
　?。ㄈ┥虾＋I血員腸道病毒VP1非中和抗體反應的動態(tài)監(jiān)測
　　為深入探究腸道病毒的非中和抗體反應能否用于腸道病毒流行情況的檢測，本實驗繼續(xù)應用NEIBM-ELISA和競爭ELISA兩種方法，檢測腸道病毒A種的CA10，CA6，CA16，EV71，腸道病毒B種的CB3，腸道病毒C

7、種的PV1六種腸道病毒VP1在2014年4月、2014年6月、2014年8月、2014年10月、2014年12月和2015年3月收集的上海市正常獻血員血清中的非中和抗體反應的動態(tài)變化。對抗體反應水平、抗體反應相關系數(shù)、競爭抑制水平和競爭抑制的相關系數(shù)等指標的分析發(fā)現(xiàn):不同時間，各病毒VP1的反應性水平無明顯變化;不同時間，抗體反應的相關系數(shù)相對平穩(wěn);不同時間，各病毒VP1競爭抑制率的差異無統(tǒng)計學意義。與上述指標不同的是，競爭抑制率相關系

8、數(shù)有很明顯的變化:CA16 VP1與EV71 VP1競爭抑制抗-CA16 VP1的相關系數(shù)隨時間變化明顯，2014年4月和6月，二者相關系數(shù)小于0.1，8月-12月二者相關系數(shù)均大于0.4，提示2014年4月，正常人群中可能有CA16的流行;2014年8月，CB3 VP1與除CB3以外的其他腸道病毒VP1競爭抑制抗-CB3 VP1的相關系數(shù)出現(xiàn)了一致的明顯下降，提示2014年8月，正常人群中可能有CB3的流行;2014年6月，CA10

9、VP1與除CA10以外的其他腸道病毒VP1競爭抑制抗-CA10VP1的相關系數(shù)出現(xiàn)了一致的明顯下降，提示2014年6月，正常人群中可能有CA10的流行;2014年10月，PV1 VP1與除PV1以外的其他腸道病毒VP1競爭抑制抗-PV1VP1的相關系數(shù)出現(xiàn)了一致的明顯下降，提示2014年10月，正常人群中可能有PV1的流行。
　　為驗證上述對腸道病毒在正常人群中流行狀況的推測，我們又進行了正常獻血員血清抗腸道病毒VP1-IgG、I

10、gM的非中和抗體檢測。分析抗體反應水平和相關系數(shù)可知，2014年4月，抗-CA16 VP1 IgG和IgM抗體反應水平與其他月份有統(tǒng)計學差異，2014年4月至8月，抗-CA16 VP1 IgG和IgM抗體反應相關系數(shù)大于0.4，高于其他月份，支持2014年6月正常人群中有CA16的流行;2014年8月-12月，抗-CB3 IgG和IgM反應性相關系數(shù)大于0.3，高于其他月份，支持2014年8月正常人群中有CB3的流行;2014年6月抗-