新型抗人腸道病毒71型單克隆抗體中和保護作用的結構基礎及機制.pdf

1、人腸道病毒71型(enterovirus71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是手足口病最常見的病原體。自1969年被發(fā)現(xiàn)以來，EV71已經(jīng)在全世界范圍內，尤其是亞太地區(qū)引起了數(shù)十次手足口病的大流行，造成了數(shù)千萬人感染，數(shù)萬患者產生嚴重的并發(fā)癥。我國是手足口病疫情的高發(fā)區(qū)，2009年以來，該疾病的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)連續(xù)7年位居丙類傳染病之首。盡管現(xiàn)在EV71的疫苗完成三期臨床試驗準備上市，但是對于重癥患者，目前尚無有效的治療策略，因此研制

2、抗病毒的特效藥物迫在眉睫。
　　EV71病毒顆粒是一個直徑約300埃的正二十面體結構，成熟病毒衣殼由VP1、VP2、VP3和VP4組成，其中VP2、VP3和VP1的大部分區(qū)域位于病毒衣殼外部，VP4和VP1的N端位于衣殼的內部。研究表明，在脫衣殼的過程中，病毒構象會發(fā)生改變，5次軸處附近的“峽谷”發(fā)生坍塌形成小孔，疏水口袋內的鞘氨醇分子釋放;2次軸處的VP2的反向平行α螺旋對會像兩側平移，形成直徑超過9埃的“孔洞”，埋藏在2次軸正

3、下方的VPl N端會遷移到病毒外部，參與核酸釋放通道的形成。因此篩選針對不同結合表位的單克隆抗體有助于進一步闡述病毒脫衣殼的生物學機制。
　　本課題采用滅活病毒和重組衣殼蛋白分別免疫Balb/C小鼠，運用經(jīng)典的雜交瘤篩選技術，獲得了15株可以特異性結合EV71病毒的單克隆抗體，其中包括6株中和保護抗體。動物保護實驗證明，在10ug/g乳鼠體重抗體的使用劑量下，6G5、12B6、2B6、2G12的保護效率均能達到100％，在2ug/

4、g的抗體劑量下，6G5的保護率仍能維持100％，12B6也能達到80％的保護，高于目前文獻所報道的中和保護性單抗。針對目前EV71可以引起無菌性腦膜炎(asepic meningitis)、腦炎(encephalitis)、腦脊髓炎(encephalomyelitis)和急性弛緩性麻痹(acute flaccid paralysis，AFP)等嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，我們同時也在神經(jīng)細胞上測試了15株單克隆抗體的中和保護效果，發(fā)現(xiàn)與人橫紋

5、肌瘤細胞相比，在相同滴度病毒的攻擊下，2B6的保護效果有了大幅度的提高。究其原因，推測是因為EV71在肌肉組織和神經(jīng)系統(tǒng)不同的入侵機制所導致。
　　根據(jù)體內外保護功能和識別表位的異同可以將中和保護抗體分為3類進行研究，第一類2B6、2G12可以結合VP1-GHloop上的215-KQEKD-219，第二類7G6、12H3識別VP1 N端的4-VADVI-8，第三類6G5、12B6為空間表位，為鑒定6G5所識別表位，我們運用冷凍電鏡

6、技術，解析6G5Fab與三種不同病毒生理周期的復合物結構，包括6G5Fab-天然成熟病毒，6G5Fab-空心病毒和6G5Fab-皺縮的空心病毒，分辨率分別達到了5.6埃、4.9埃和5.0埃。6G5識別位點位于病毒顆粒的2次軸和3次軸之間，分布在VP2和VP3的交匯處，包括VP2上135-139位的LDTKL，223-226位的GADG，296-298位的GAT和VP3上73-81位的VSAQAGKGE，144-147位的KDRA，209

7、-212位的PNTA。這些構成了一個由“凹槽”“把手”和“峽谷”組成的復雜的結合區(qū)域。通過突變6G5可變區(qū)上與病毒表位相互作用的關鍵氨基酸，發(fā)現(xiàn)組成該空間表位的6個功能域均參與了6G5與病毒的結合。
　　隨后我們深入研究了三類抗體的中和保護機制，發(fā)現(xiàn)2B6的結合通過降低VP1-GHloop的柔性來穩(wěn)定5次軸附近“峽谷”底部的結構，從而抑制病毒的構象變化，影響病毒的脫顆粒進程;7G6可以阻礙病毒核酸通道的形成，抑制病毒核酸的釋放;最