虎杖苷在腎臟缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、背景：急性腎臟缺血再灌注（Ischemia reperfusion，IR）損傷是腎移植等外科術(shù)后常見的并發(fā)癥。一旦發(fā)生，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。目前尚缺乏特效藥物，臨床上主要通過腎臟替代療法（包括血液透析和腹膜透析）暫時(shí)替代患者的腎臟功能，被動(dòng)地等待其腎臟功能的自我恢復(fù)。如果能夠找到治療急性腎臟IR損傷的有效藥物，將會(huì)具有很好的臨床應(yīng)用前景。
　　虎杖苷（Polydatin，PD）是一種具有多種藥理學(xué)活性的天然抗氧化劑，其在多種缺血性

2、損傷器官中顯示出良好的保護(hù)作用。盡管部分研究顯示PD在腎臟IR損傷中具有明顯的保護(hù)效果，但其在IR損傷腎臟的具體作用機(jī)制仍然有待進(jìn)一步探討。
　　目的：本研究擬通過建立腎臟 IR損傷的小鼠模型和體外培養(yǎng)細(xì)胞模型，對 PD在IR損傷腎臟的保護(hù)作用進(jìn)行評價(jià)，并探討其潛在的分子機(jī)制。通過檢測小鼠的血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN），評價(jià)PD在改善模型小鼠腎臟功能方面的作用；通過對腎臟組織進(jìn)行病理學(xué)評分（HSK）和凋亡染色（TUNEL），

3、評價(jià)PD在降低模型小鼠腎臟組織損傷程度方面的作用；通過測定氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥相關(guān)分子，評價(jià)PD在 IR損傷腎臟的抗氧化應(yīng)激和抗炎效果；通過應(yīng)用特異性抑制劑渥曼青霉素（Wortmannin，Wort）阻斷磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，以及在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中加入人音猬（Sonic hedgehog, Shh）因子重組蛋白來激活Shh信號通路，進(jìn)一步探討PD在腎臟IR損傷中發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的潛在分子機(jī)制。
　

4、　方法：實(shí)驗(yàn)一，20~25 g的雄性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為5組：（1）假手術(shù)組；（2）IR組；（3）PD低劑量（10 mg/kg）組；（4）PD中劑量（20 mg/kg）組；（5） PD高劑量（40 mg/kg）組。通過夾閉雙側(cè)腎蒂阻斷腎臟血供30 min，然后恢復(fù)血供的方法，建立腎臟IR損傷小鼠模型。假手術(shù)組僅開腹，游離但不夾閉腎蒂。術(shù)后第3天取小鼠的血液和腎臟。通過檢測血清中Scr和BUN的水平，對腎臟標(biāo)本進(jìn)行HSK評分和TUN

5、EL凋亡染色，評價(jià)小鼠的腎功能和腎組織損傷程度。比色法檢測腎組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活力。Western blot檢測腎組織中環(huán)氧化物合成酶-2（COX-2）、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）的表達(dá)和Akt的磷酸化水平。ELISA法檢測小鼠腎組織中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、前列腺素E-2（PGE-2）的含量。
　　實(shí)驗(yàn)二，20~2

6、5 g的雄性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為6組：（1）假手術(shù)組；（2）假手術(shù)給予Wort干預(yù)組；（3）腎臟IR損傷模型組；（4）模型給予Wort干預(yù)組；（5） PD（40 mg/kg）干預(yù)組；（6）PD（40 mg/kg）干預(yù)合并給予Wort干預(yù)組。在本部分實(shí)驗(yàn)中，給予小鼠腹腔內(nèi)注射PI3K/Akt通路抑制劑Wort（1 mg/kg）用于阻斷其體內(nèi)Akt的活化。術(shù)后第3天取小鼠的血液和腎臟。通過檢測Scr和BUN，對腎臟標(biāo)本進(jìn)行HSK評分和

7、TUNEL凋亡染色，評價(jià)小鼠的腎功能和腎組織損傷程度。比色法檢測腎組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、NO的含量和SOD的活力。Western blot法檢測腎組織中COX-2、iNOS的表達(dá)和Akt的磷酸化水平。ELISA法檢測小鼠腎組織中TNF-α、IL-1β和PGE-2的含量。
　　實(shí)驗(yàn)三，在常氧或氧-糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）條件下培養(yǎng)人類近端腎小管上皮細(xì)胞系（HK-2），并給予相應(yīng)的藥物干預(yù)（包括PD、Wort和Shh蛋白）。MT

8、T法評價(jià)HK-2細(xì)胞的存活能力。ELISA法檢測TNF-α和IL-1β在培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中的含量。Western bolt法檢測細(xì)胞中Akt蛋白的磷酸化水平和Shh蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)一，與模型組相比，高劑量 PD顯著降低了腎臟 IR損傷小鼠的Scr和BUN，顯著降低了IR損傷腎臟的HSK和TUNEL陽性細(xì)胞率，顯著降低了IR損傷腎臟中MDA的含量，并明顯上調(diào)了IR損傷腎臟中SOD的活性（P<0.05）。在腎臟IR損傷

9、小鼠模型的腎臟組織，高劑量的PD顯著上調(diào)了Akt的磷酸化水平，顯著抑制了COX-2和iNOS的表達(dá)，并顯著減少了COX-2和iNOS的下游產(chǎn)物分子PGE-2和NO的產(chǎn)生（P<0.05）。ELISA結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，TNF-α和IL-1β在IR損傷腎臟中的表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，20和40 mg/kg的PD均顯著地抑制了TNF-α和IL-1β在IR損傷腎臟組織中的表達(dá)（P<0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)二，Wes

10、tern blot顯示，腹腔注射1 mg/kg的Wort可顯著抑制模型小鼠腎臟中Akt的磷酸化（P<0.05）。與單用PD處理而不加Wort組相比較，PD聯(lián)合Wort干預(yù)明顯增加了腎臟IR損傷小鼠的BUN和Scr，明顯增加了其腎臟的HSK和TUNEL陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，并明顯削弱了PD的抗氧化應(yīng)激（包括減少M(fèi)DA含量和增加SOD活性）和抗炎（包括抑制 TNF-α、IL-1β、COX-2和 iNOS的表達(dá)和降低 PGE-2和NO的含量）效果（

11、P<0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)三，PD明顯改善OGD/R模型細(xì)胞的存活，并顯著抑制OGD/R誘導(dǎo)上調(diào)的細(xì)胞對TNF-α和IL-1β的分泌；抑制PI3K/Akt信號通路的激活可削弱PD的促細(xì)胞存活和抗炎作用；PD上調(diào)Shh蛋白在OGD/R細(xì)胞的表達(dá)，抑制PI3K/Akt通路激活會(huì)導(dǎo)致PD上調(diào)Shh蛋白表達(dá)的效果被降低；外源給予Shh蛋白促進(jìn)了OGD/R細(xì)胞的存活，并顯著降低細(xì)胞的炎性反應(yīng)（P<0.05）。
　　結(jié)論：PD可改善腎臟