遠(yuǎn)端缺血后處理在大鼠全腦缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、在各種疾病(腦卒中、微血栓、腦血管痙攣和硬化、腦血液動(dòng)力學(xué)改變、頸部動(dòng)脈疾病或椎動(dòng)脈受壓等)或手術(shù)(嚴(yán)重顱腦外傷手術(shù)、控制性降壓、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤夾閉術(shù)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)以及頸動(dòng)脈血管移植術(shù)等)中會(huì)出現(xiàn)全部或局部的腦組織的短暫缺血,引起腦組織血液灌注不足,疾病經(jīng)過(guò)積極治療后或手術(shù)結(jié)束后會(huì)恢復(fù)腦組織的血液供應(yīng),但缺血后的血流供應(yīng)恢復(fù)在某些情況下可導(dǎo)致腦組織損傷和功能障礙的加重,這種恢復(fù)血流灌注后的腦組織損傷和功能障礙加重現(xiàn)象稱(chēng)為腦缺血再灌注損

2、傷(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIR)。為了減輕腦缺血造成的損傷,降低腦缺血的死亡率,如何有效的防治缺血缺氧性腦損傷已經(jīng)成為當(dāng)今神經(jīng)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。近年來(lái)針對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)研究越來(lái)越多,研究背景大量研究試圖尋找可減輕或預(yù)防腦缺血再灌注損傷的方法或藥物,并且己經(jīng)在動(dòng)物模型上獲得一定成功,但是這些方法和藥物很少能成功用于臨床。
　　缺血再灌注損傷后短暫的亞致死性缺血或其它亞

3、致死性應(yīng)激可對(duì)隨后的損傷性缺血提供保護(hù)作用,此現(xiàn)象被稱(chēng)為缺血后處理。最先在心臟發(fā)現(xiàn)缺血后處理的保護(hù)作用,隨后許多學(xué)者研究證實(shí)了在腦、脊髓、骨骼肌、肝臟、腎臟、肺臟和小腸等器官組織也存在缺血后處理現(xiàn)象。最近,有研究發(fā)現(xiàn),一個(gè)器官的短暫缺血可誘導(dǎo)另一器官的缺血耐受,此現(xiàn)象被學(xué)者們稱(chēng)為遠(yuǎn)端缺血后處理。目前許多關(guān)于遠(yuǎn)端缺血后處理的研究是針對(duì)心臟和腎臟的,遠(yuǎn)隔后處理是否對(duì)腦也能提供保護(hù)作用還不清楚。但是神經(jīng)元與其它細(xì)胞在遺傳信息方面是相似的,因此

4、我們有理由認(rèn)為其它器官的適度應(yīng)激可對(duì)腦也能夠提供保護(hù)作用。為證實(shí)這一設(shè)想,本研究采用全腦缺血模型,觀(guān)察遠(yuǎn)端肢體缺血后處理(limb ischemic postconditioning,LIP)對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響。
　　本研究選擇健康成年SD大鼠作為研究對(duì)象,采用四動(dòng)脈阻斷法行全腦缺血再灌注模型,觀(guān)察遠(yuǎn)端肢體缺血后處理對(duì)大鼠腦缺血/再灌注(I/R)損傷的影響,研究遠(yuǎn)端肢體缺血后處理對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用,從而探討遠(yuǎn)端肢體缺血后處理是

5、否有腦保護(hù)作用,并且進(jìn)一步研究PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路是否介導(dǎo)這一作用。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)Nissl染色評(píng)價(jià)定大鼠海馬CA1區(qū)和額葉皮層在腦缺血再灌注后神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變,觀(guān)察其中存活神經(jīng)元密度,用Morris水迷宮檢測(cè)空間學(xué)習(xí)與記憶能力的改變,通過(guò)檢測(cè)遠(yuǎn)端肢體缺血后處理對(duì)腦缺血再灌注后大鼠遲發(fā)性神經(jīng)元死亡和大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力的影響,證明遠(yuǎn)端肢體缺血后處理的神經(jīng)保護(hù)作用。以此為基礎(chǔ),于I/R后24h和48h取海馬CA1區(qū)組織用W

6、estern blot及免疫組化法檢測(cè)中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的表達(dá)水平。然后用TUNEL法檢測(cè)48h海馬CA1區(qū)及額葉皮層的神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況,然后,通過(guò)48h檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)等指標(biāo)來(lái)檢測(cè)神經(jīng)元的氧化應(yīng)激水平,觀(guān)察遠(yuǎn)端肢體缺血后處理對(duì)大鼠全腦缺血再灌注損傷的影響。隨后,第三部分則于I/R后再灌注48 h時(shí)行海馬CA1區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù),測(cè)定I/R后再濯注48h時(shí)海馬C

7、A1區(qū)p-eNOS、eNOS、p-Akt及Akt的蛋白表達(dá)水平,再灌注4 d時(shí)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),再灌注7 d時(shí)計(jì)算海馬Cal區(qū)神經(jīng)元密度。觀(guān)察eNOS及PI3K/Akt通路在遠(yuǎn)端肢體缺血后處理(RIPoC)減少大鼠全腦缺血在灌注(I/R)損傷中的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):①遠(yuǎn)端肢體缺血后處理(RIPoC)對(duì)明顯減少缺血再灌注所導(dǎo)致的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡及錐體神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)揮著明顯的神經(jīng)保護(hù)作用,它可以減少大腦的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡,

8、從而可以使大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力的減退得到明顯改善,發(fā)揮其在全腦I/R損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用。②RIPoC在大鼠的全腦缺血再灌注中可以通過(guò)改善氧化應(yīng)激水平,調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白減少大腦的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡,說(shuō)明遠(yuǎn)端肢體缺血后處理對(duì)大鼠再灌注損傷的腦保護(hù)作用與氧化應(yīng)激和腦組織相關(guān)蛋白分子相關(guān)聯(lián),RIPoC在大鼠的全腦缺血再灌注中可以通過(guò)改善氧化應(yīng)激水平及調(diào)節(jié)腦組織相關(guān)蛋白分子發(fā)揮其在全腦I/R損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用。③預(yù)先使用一氧化氮合酶抑制劑L

9、-NAME和PI3K抑制劑LY294002能夠有效地抑制RIPoC腦保護(hù)作用,證實(shí)在全腦缺血再灌注模型中RIPoC的腦保護(hù)作用是與PI3K/Akt/eNOS通路有關(guān)。RIPoC是通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路,促進(jìn)Akt的激活,進(jìn)而減少全腦缺血再灌注損傷的。使用一氧化氮合酶抑制劑L-NAME能夠減少RIPoC后的eNOS及p-eNOS的表達(dá),并有效地抑制RIPoC的腦保護(hù)作用。同時(shí),使用PI3K抑制劑LY294002能夠明顯減少RIP

10、oC后eNOS及p-eNOS的表達(dá)。說(shuō)明RIPoC通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路,促進(jìn)eNOS的激活,從向發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用。PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路在RIPoC的腦神經(jīng)保護(hù)過(guò)程中起著重要的作用。
　　本課題的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分為三部分:
　　1遠(yuǎn)端肢體缺血后處理對(duì)大鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　2遠(yuǎn)端肢體缺血后處理對(duì)大鼠全腦缺血再灌注損傷中腦組織相關(guān)蛋白分子的影響。
　　3 PI3K/Akt/eNO

11、S通路在遠(yuǎn)端肢體缺血后處理減少全腦缺血再灌注損傷中的作用。
　　第一部分肢體遠(yuǎn)端缺血后處理對(duì)大鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　[摘要]目的:研究遠(yuǎn)端肢體缺血后處理(RIPoC)在大鼠的全腦缺血再灌注(I/R)模型中的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。方法:用四動(dòng)脈阻斷法(4-VO)制作全腦I/R模型。選擇雄性SD大鼠(200-250g)。隨機(jī)分為四組:sham組,I/R組,I/R+RIPoC組,RIPoC組。于I/R后7d取大鼠海馬

12、CA1區(qū)和額葉皮層組織行Nissl染色,觀(guān)察中存活神經(jīng)元密度,于I/R后4d開(kāi)始用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力的改變。結(jié)果:同I/R組相比,I/R+RIPoC組中海馬CA1區(qū)及額葉皮層中I/R后遲發(fā)性神經(jīng)元死亡明顯減少(P＜0.01),空間學(xué)習(xí)和記憶能力的減退明顯改善(P＜0.05)。結(jié)論:RIPoC在大鼠的全腦I/R中可以減少大腦的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡,從而改善空間學(xué)習(xí)與記憶能力,發(fā)揮其在全腦I/R損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用。<

13、br>　　第二部分肢體遠(yuǎn)端缺血后處理對(duì)大鼠全腦缺血再灌注損傷中腦組織相關(guān)蛋白分子的影響
　　[摘要]目的:探討遠(yuǎn)端肢體缺血后處理對(duì)大鼠再灌注損傷的腦保護(hù)作用與氧化應(yīng)激的關(guān)聯(lián),與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)。方法:用四動(dòng)脈阻斷法(4-VO)制作全腦I/R模型。選擇雄性SD大鼠(200-250g)。隨機(jī)分為四組:sham組,I/R組,I/R+RIPoC組,RIPoC組。電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈后夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈至8min后松開(kāi),再灌注開(kāi)始立即夾

14、閉雙側(cè)股動(dòng)脈實(shí)行15min缺血/15min再灌注,共計(jì)3個(gè)循環(huán);于I/R后24h和48h用TUNEL法檢測(cè)海馬Cal區(qū)和額葉皮層的神經(jīng)元凋亡,于I/R后48h檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)。于I/R后24h和48h取海馬CA1區(qū)組織用Westernblot及免疫組化法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的表達(dá)水平。結(jié)果:同I/R組相比,,I/R+RIPoC組中海馬CA1區(qū)及額葉皮層中I/R后遲發(fā)性神經(jīng)

15、元死亡及TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P＜0.01),海馬Cal區(qū)中Bcl-2明顯上調(diào),Bax明顯下調(diào)(P＜0.01),SOD和CAT的活性明顯增加,MDA水平明顯降低(P＜0.01)。結(jié)論:RIPoC在大鼠的全腦缺血再灌注中可以通過(guò)改善氧化應(yīng)激水平,調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白減少大腦的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡,發(fā)揮其在全腦I/R損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第三部分 PI3K/Akt/eNOS通路在遠(yuǎn)端缺血后處理減少全腦缺血再灌注損傷中的作用

16、r>　　[摘要]目的探討eNOS及PI3K/Akt通路在遠(yuǎn)端肢體缺血后處理(RIPoC)減少大鼠全腦缺血在灌注(I/R)損傷中作用。方法成年雄性SD大鼠100只,體重為200～250 g,隨機(jī)分為5組(n=20):假手術(shù)組(S組)、I/R組、I/R+RIPoC組、L-NAME+I/R+RIPoC組及LY294002+I/R+RIPoC組。采用四動(dòng)脈阻斷法建立大鼠全腦缺血再灌注模型。S組不制備全腦缺血再灌注模型;I/R+RIPoC組、L-

17、NAME+I/R+RIPoC組及LY+I/R+RIPoC組于再灌注開(kāi)始行雙側(cè)股動(dòng)脈缺血15 min,再灌注15 min,共計(jì)3個(gè)循環(huán)。L-NAME+I/R+RIPoC組于缺血前10min腹腔注射非選擇性一氧化氮合酶(NOS)抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME),LY+I/R+RIPoC組于缺血前10min側(cè)腦室注射磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特異性抑制劑LY294002。再灌注48 h時(shí)行海馬CA1區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù),測(cè)定海馬

18、CA1區(qū)p-eNOS、eNOS、p-Akt及Akt的蛋白表達(dá)水平,再灌注4 d時(shí)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),再灌注7 d時(shí)計(jì)算海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度。結(jié)果與S組比較,I/R組、I/R+RIPoC組、L-NAME+I/R+RIPoC組及LY+I/R+RIPoC組再灌注時(shí)海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞增加,神經(jīng)元密度降低,行為學(xué)損傷增加。與I/R組比較,I/R+RIPoC組再灌注時(shí)凋亡細(xì)胞減少,神經(jīng)元密度增加,行為學(xué)損傷明顯減少。與I/R+RIPoC組