斜紋夜蛾Spodoptera litura Fabricius卵黃原蛋白-受體基因的分子特征和功能分析及其對(duì)重金屬鋅、鉛脅迫的響應(yīng).pdf

1、卵黃發(fā)生(Vitellogenesis)是昆蟲卵巢成熟的關(guān)鍵，直接影響昆蟲的繁殖力。卵黃發(fā)生的核心問(wèn)題是卵黃原蛋白(Vitellogenin，Vg)的合成和攝取，絕大多數(shù)昆蟲Vg由雌蟲脂肪體合成，分泌到血淋巴中，通過(guò)卵黃原蛋白受體(Vitellogenin recepotor，VgR)調(diào)節(jié)的內(nèi)吞作用由卵母細(xì)胞攝取。Vg被卵母細(xì)胞攝取后，以卵黃蛋白(Vitellin，Vn)晶體形式積累在卵母細(xì)胞中，為胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。昆蟲Vg為雌性特

2、異性蛋白，其發(fā)生過(guò)程受到激素調(diào)控，對(duì)重金屬等環(huán)境雌激素反應(yīng)敏感。通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物Vg的變化，可以監(jiān)控和評(píng)價(jià)環(huán)境雌激素污染的程度。因此，害蟲Vg和VgR的分子特征和功能研究不僅有助于深入理解害蟲生殖的分子機(jī)制，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中探求合理的害蟲防治方法提供理論基礎(chǔ)，而且可為利用昆蟲Vg作為生物標(biāo)記物監(jiān)控環(huán)境雌激素污染提供理論依據(jù)。 本文以斜紋夜蛾Spodoptera litura Fabricius(Lepidoptera： Noctuida

3、e)為試蟲，克隆和分析了Vg和VgR基因的分子特征；運(yùn)用RNAi技術(shù)抑制了Vg和VgR基因的表達(dá)和調(diào)控了此蟲生殖；采用飼料重金屬脅迫法，研究了鋅(Zinc，Zn)和鉛(Lead，Pb)對(duì)此蟲生殖以及Vg的影響。主要結(jié)果如下： 1.克隆了Vg cDNA和部分VgR cDNA，命名為SlVg(登錄號(hào)EU095334)和SlVgR(未登錄)。SlVg全長(zhǎng)5339 bp，ORF為5247 bp，編碼1748個(gè)氨基酸；Vg包含三個(gè)保守區(qū)域

4、(Vitellogenin—N domain，DUF1943和von Willebrand factor type D domain(VWD))，一條17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和一個(gè)蛋白卵裂位點(diǎn)(RTIR)；C—末端有高度保守的GL/ICG，DGXR和半胱氨酸殘基(C)。SlVgR已克隆3342 bp，編碼1113個(gè)氨基酸，屬于低密脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)基因家族，包含4個(gè)LDL

5、a保守結(jié)構(gòu)。 2.SlVg mRNA在雌性脂肪體中特異表達(dá)，開始表達(dá)的時(shí)間是第6天蛹，表達(dá)水平隨著發(fā)育階段增加，成蟲羽化24 h達(dá)到最高峰，隨后逐漸減少；Western blot分析表明血淋巴中的Vg僅在雌蟲中出現(xiàn)，分布模式與SlVg mRNA表達(dá)模式相似，但發(fā)生時(shí)間推后24 h。SlVgR mRNA僅在雌蟲的卵巢中表達(dá)，開始表達(dá)的時(shí)間是第6天蛹，隨著發(fā)育階段增加，成蟲羽化36 h表達(dá)量達(dá)到最高峰，隨后急劇減少；VgR蛋白的分布

6、模式與SlVgR mRNA表達(dá)相似，但開始出現(xiàn)時(shí)間推遲了24 h，而最高峰提前了12 h。 3.第4天蛹注射3μg SlVg dsRNA是RNAi干擾SlVg的最佳時(shí)期和最佳濃度。RNA干涉Vg后，卵巢發(fā)育滯后且異常，產(chǎn)卵量顯著減少，SlVg表達(dá)受抑制；第6天蛹注射SlVg dsRNA，在成蟲后期階段起到干擾作用，但對(duì)蛹期沒(méi)有影響；在斜紋夜蛾發(fā)育的蛹和成蟲階段注射5μg SlVg dsRNA會(huì)影響斜紋夜蛾蟲體的發(fā)育，導(dǎo)致死亡；第

7、4或6天蛹注射3μg或5μg SlVgR dsRNA后產(chǎn)卵量顯著減少，羽化24 h雌成蟲血淋巴中Vg顯著增加；幼蟲和剛羽化成蟲注射dsRNA不影響斜紋夜蛾卵巢發(fā)育、產(chǎn)卵量和Vg。 4.高濃度Zn和Pb脅迫影響斜紋夜蛾生殖。750 mg Zn/kg脅迫下，斜紋夜蛾生殖參數(shù)(產(chǎn)卵天數(shù)、產(chǎn)卵力、生育力、孵化率和卵的重量)顯著下降，分別是對(duì)照的66.67％、31.43％、20.95％、48％和64.97％；能引起斜紋夜蛾生殖參數(shù)顯著減少

8、的最低Pb濃度是25 mg Pb/kg；200 mg Pb/kg脅迫后，生殖參數(shù)分別是對(duì)照的51.85％、13.12％、7.34％、25.04％和22.11％。Zn和Pb脅迫下，斜紋夜蛾Vg mRNA和Vg蛋白水平下降。Zn脅迫后，羽化24 h雌成蟲脂肪體中SlVg mRNA表達(dá)和血淋巴中Vg水平隨著飼料中Zn濃度增加而顯著減少：SlVg開始表達(dá)的時(shí)間延遲1-2天；雄成蟲脂肪體中的SlVg沒(méi)有表達(dá)，血淋巴中也檢測(cè)不到Vg蛋白；卵中積累的

9、Vn在750 mg Zn/kg脅迫后顯著下降，僅對(duì)照的38.7％，而150和300 mg Zn/kg顯著提高Vn的積累，分別是對(duì)照的1.87和1.65倍。Pb脅迫后，羽化24 h雌成蟲脂肪體中SlVg表達(dá)和血淋巴中Vg水平隨著飼料中Pb濃度增加而減少：SlVg開始表達(dá)的時(shí)間提前了2-3天；在12.5和25 mg Pb/kg處理后雄成蟲脂肪體中的SlVg有表達(dá)，但在血淋巴中檢測(cè)不到Vg；卵中積累的Vn受到顯著抑制，200 mg Pb/kg