家蠶卵黃原蛋白受體(BmVgR)的全長克隆及功能分析.pdf

1、家蠶作為鱗翅目模式昆蟲和重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，其基因組框架圖及精細(xì)圖的完成，加上本實(shí)驗(yàn)室擁有的600多個家蠶基因突變品系，為家蠶的功能基因研究提供了豐富資源。卵黃原蛋白受體(Vitellogenin receptor,VgR)是卵生動物的卵巢及胚胎發(fā)育的重要基因，它的主要功能是通過胞吞作用介導(dǎo)卵黃原蛋白(Vitellogenin，Vg)進(jìn)入卵巢，為卵母細(xì)胞發(fā)育提供營養(yǎng)。目前為止，已經(jīng)報道了11種昆蟲VgR的cDNA及基因組序列，它們都屬于低密

2、度脂蛋白受體，具有典型的LDLR保守功能結(jié)構(gòu)域。昆蟲卵黃原蛋白受體的表達(dá)分析顯示，VgR在卵黃發(fā)生的整個時期都有表達(dá)，表達(dá)的組織限定在卵巢中。果蠅及雞類的卵黃原蛋白受體的缺失突變體不能產(chǎn)卵；在美洲狗蜱、長角血蜱和火蟻中，應(yīng)用dsRNA介導(dǎo)的干擾技術(shù)對VgR進(jìn)行沉默，結(jié)果對卵巢的發(fā)育都造成了一定的影響，卵子不能形成或產(chǎn)生畸形卵，這些都表明VgR在卵巢發(fā)育過程中具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室已報道了家蠶卵黃原蛋白受體基因(BmVgR)3'端的部分

3、序列。本研究在現(xiàn)有的BmVgR基因序列和家蠶全基因組數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，利用RT-PCR、基因克隆、原位雜交、Northern雜交等技術(shù)對BmVgR的全長cDNA進(jìn)行了克隆及表達(dá)定位分析；并結(jié)合家蠶白妙卵(vit)突變體及RNAi技術(shù)對家蠶BmVgR的功能進(jìn)行了初步探討，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.家蠶卵黃原蛋白受體的信息分析及全長克隆
　　 本實(shí)驗(yàn)在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，對家蠶卵黃原蛋白受體的信息分析顯示，BmVgR

4、位于家蠶第20號染色體上的nscaf481上。通過片段克隆、測序、拼接，結(jié)果獲得了BmVgR的cDNA全長序列5746bp(登錄號為：HM172611)。該基因有35個外顯子，基因組大于70kb，包含了完整的開放閱讀框，信號肽的位置在氨基酸17-18aa之間，即在氨基酸結(jié)點(diǎn)CVG-QF處，信號肽包含17個氨基酸殘基MKVVLLAIVLCTTSCVG。BmVgR編碼的蛋白含1809個氨基酸殘基，預(yù)測蛋白分子量為202.5kDa，等電點(diǎn)為5

5、.54。氨基酸的多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，BmVgR與其它昆蟲物種的卵黃原蛋白受體一樣，具有低密度脂蛋白受體家族的保守功能域；卵黃原蛋白受體的進(jìn)化分析顯示，它與傳統(tǒng)的物種進(jìn)化關(guān)系一致。
　　 2.家蠶卵黃原蛋白受體的轉(zhuǎn)錄特性及細(xì)胞定位
　　 通過RT-PCR方法對BmVgR的組織、時期表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，BmVgR只特異的在卵巢組織中表達(dá)，在其它的組織如觸角、頭、胸、腹、翅、尾部以及卵管中都不表達(dá)。進(jìn)一步原位雜交結(jié)果顯示，

6、BmVgR在卵巢的卵母細(xì)胞中表達(dá)。時期表達(dá)譜顯示，BmVgR在家蠶雌性個體的整個生命周期中都有表達(dá)，只是從胚胎期到幼蟲期的五齡第五天表達(dá)量一直較低，到卵黃原蛋白(BmVg)在上蔟第一天開始表達(dá)的前兩天開始上調(diào)表達(dá)，到化蛹第四、五天表達(dá)量最高，該結(jié)果顯示，BmVgR的上調(diào)表達(dá)與家蠶卵成熟時期基本一致。
　　 3.卵黃原蛋白受體在家蠶白妙卵突變體中的突變檢測及表達(dá)分析
　　 對家蠶vit突變體的BmVgR的cDNA全長進(jìn)行了

7、克隆，其序列與正常大造的BmVgR比對，發(fā)現(xiàn)vit突變體的BmVgR相比大造的缺失兩個片段，第一個缺失片段為BmVgR的1680-1832bp位置，氨基酸殘基位置為560-609aa，即第一個表皮生長因子前體區(qū)域的第三個ClassB區(qū)域，該片段的缺失是vit突變體所特有的。第二個片段為BmVgR的3879-3941bp位置，在蛋白的一級結(jié)構(gòu)域上缺失了第二個表皮生長因子前體區(qū)域的第一個ClassB區(qū)域。Northern雜交分析顯示，大造與

8、vit突變體的BmVgR的表達(dá)量和大小的差異都不明顯。結(jié)合已有的研究報道，推測BmVgR的第一個片段缺失對該基因編碼蛋白的二聚化，以及與配體結(jié)合后的解離，起著十分重要的作用，這可能正是導(dǎo)致vit突變體的卵母細(xì)胞不能正常攝取卵黃原蛋白的原因，但要完全明確vit突變體是由于BmVgR突變導(dǎo)致的，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。
　　 4.家蠶卵黃原蛋白受體的RNAi研究
　　 通過dsRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)對家蠶化蛹第一天的雌

9、蛹進(jìn)行BmVgR轉(zhuǎn)錄沉默，并連續(xù)在化蛹第四天、第七天進(jìn)行干涉。結(jié)果顯示，注射了dsVgR的雌蛹能正常發(fā)育到化蛾，化蛾交配后，所產(chǎn)下的卵中有小卵，卵色偏白，卵的大小不到正常的一半，并且不能孵化；而注射了elution buffer和dsRed的雌蛹也能正常發(fā)育，化蛾交配所產(chǎn)的卵大小均一。熒光定量檢測結(jié)果顯示注射了dsVgR的雌蛹化蛾后所產(chǎn)小卵的BmVgR表達(dá)量明顯比對照低；進(jìn)一步通過Elisa實(shí)驗(yàn)也證實(shí)小卵的卵黃原蛋白的含量比對照少很多。