大鼠放射性肝損傷分子應(yīng)答及機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過(guò)觀察放射性肝損傷（RILD）大鼠模型中的相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平變化，找到減少放射性肝損傷作用和早期診斷損傷發(fā)生的生物標(biāo)記分子以及引起相關(guān)信號(hào)通路改變的關(guān)鍵靶點(diǎn)；分析并引發(fā)RILD的潛在機(jī)制和治療 RILD的潛在靶點(diǎn)。
　　方法：利用單次照射總劑量20Gy建立SD大鼠放射性損傷模型。完成放療后，觀察大鼠存活情況和精神、活動(dòng)、皮毛，體重以及飲食等狀態(tài)，在各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠前檢測(cè)大鼠體重變化。在放療完成后3d，1，2，4，8，1

2、2周后分別取肝組織和血液樣本。分析大鼠血清中透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）、層粘連蛋白（Laminin，LN）、Ⅲ型前膠原（Procollagen-Ⅲ，PC-Ⅲ），以及IV型膠原（IV-C）的改變，用于分析放射性肝損傷后，肝纖維化的改變。HE染色和Masson染色法進(jìn)行大鼠放射性肝損傷組織學(xué)分析，TUNEL試劑盒分析放射性肝損傷凋亡情況。免疫組化分析放射性肝損傷細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子表達(dá)情況。Real-time PCR檢測(cè)

3、大鼠放射性肝損傷細(xì)胞因子變化。Western blot檢測(cè)大鼠放射性肝損傷細(xì)胞因子蛋白變化。分離，純化并培養(yǎng)原代大鼠 Kupffer細(xì)胞；免疫組化法鑒定 Kupffer細(xì)胞表面標(biāo)記F4/80表達(dá)。隨機(jī)分為對(duì)照組，放射組和氯化釓組。MTT法分別檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。Caspase3凋亡試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。ELISA法和Real-timePCR檢測(cè)各組細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的分泌變化。
　　結(jié)果：⑴接受照射總劑量20Gy的照射后，

4、放射性肝損傷實(shí)驗(yàn)組大鼠的體重降低，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，放射性肝損傷實(shí)驗(yàn)組大鼠體重從放射結(jié)束后第2周就逐漸降低，一直持續(xù)至第12周研究結(jié)束，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；⑵放射性肝損傷組大鼠血清AST、ALT、ALP酶活性在受照射后第2周開(kāi)始升高，照射后直至研究結(jié)束的第12周達(dá)到高峰（P＜0.05）?？偰懠t素和直接膽紅素水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；⑶透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（

5、PC-Ⅲ），以及IV型膠原（IV-C）在照射后，變化不顯著；⑷HE染色和 Masson染色可見(jiàn)放射性肝損傷病理改變隨放射后時(shí)間增加而明顯；⑸放射肝損傷后大鼠肝細(xì)胞凋亡增加；⑹免疫組化顯示TGF-β1，NF-κBp65，Smad4，Smad3，Smad7，TNF-α，CTGF在放射性肝損傷后都呈陽(yáng)性表達(dá)，且隨著放射完成時(shí)間的延長(zhǎng)，而表達(dá)增加更加明顯；⑺Realtime PCR和 Western blot結(jié)果顯示 TGF-β1，NF-κBp

6、65，Smad4，Smad3，Smad7，TNF-α，CTGF在放射性肝損傷后在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)增加，且增加程度各異差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；⑻原代培養(yǎng)的Kupffer細(xì)胞具有典型的巨噬細(xì)胞特征，純度高，經(jīng)鑒定F4/80表達(dá)陽(yáng)性；⑼接受放射后可促進(jìn)Kupffer細(xì)胞的增殖（P＜0.05）；而應(yīng)用Kupffer細(xì)胞抑制劑氯化釓作用后，Kupffer細(xì)胞增殖被抑制（P＜0.05）。接受照射可抑制Kupffer細(xì)胞Capase3的活

7、性加（P＜0.05）；而應(yīng)用Kupffer細(xì)胞抑制劑氯化釓作用后，Kupffer細(xì)胞Capase3的活性增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；⑽在放射活化的Kupffer細(xì)胞中 TGF-β1，NF-κBp65，Smad4，Smad3，Smad7， TNF-α，CTGF表達(dá)明顯增加，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。加入氯化釓作用后，可抑制細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)，與照射組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。