剪接因子hnRNP A1和ASF-SF2對(duì)UVB的響應(yīng)及其功能研究.pdf

1、過(guò)量紫外線(xiàn)照射是導(dǎo)致皮膚癌發(fā)生的重要原因，其中的發(fā)病機(jī)理一直是生物醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)方向。近年來(lái)，對(duì)于UV照射引起的基因可變剪接的研究越來(lái)越得到重視，因?yàn)閁V照射應(yīng)激下表達(dá)的基因變異體對(duì)于腫瘤的形成有重要促進(jìn)作用。其中，mdm2基因作為一種致癌基因，在多種腫瘤中表現(xiàn)出高水平表達(dá)，同時(shí)，在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了mdm2基因的多種變異體,這些變異體的出現(xiàn)對(duì)于腫瘤的發(fā)生有重要的促進(jìn)作用。并且，有研究證明UVB照射可以有效誘導(dǎo)mdm2基因的可變剪接過(guò)程，

2、但是具體的調(diào)控機(jī)制仍然不清楚。剪接因子是一類(lèi)調(diào)控基因可變剪接的重要蛋白，它們可以通過(guò)調(diào)節(jié)基因的可變剪接過(guò)程產(chǎn)生不同的基因變異體，從而導(dǎo)致細(xì)胞生理過(guò)程的改變。但是剪接因子是否調(diào)控UVB照射引起的mdm2可變剪接過(guò)程還沒(méi)有研究報(bào)道。本論文以hnRNP A1和ASF/SF2兩個(gè)重要的剪接因子為研究對(duì)象，用細(xì)胞分子生物學(xué)方法檢測(cè)了剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2在UVB引起的mdm2基因可變剪接過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用。
　　另外，剪接因

3、子hnRNP A1和ASF/SF2在多種類(lèi)型的腫瘤中都表現(xiàn)出高表達(dá)，被認(rèn)為是一種促進(jìn)癌癥的因子，研究?jī)梢蜃訉?duì)于UVB照射的響應(yīng)及細(xì)胞存活影響可以加深對(duì)皮膚癌發(fā)生機(jī)理的認(rèn)識(shí)。其中，我們研究了UVB照射劑量和時(shí)間對(duì)于hnRNP A1和ASF/SF2表達(dá)以及細(xì)胞定位的影響，也研究了在UVB照射下ROS，p53以及NF-κB和Akt信號(hào)通路對(duì)于剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2表達(dá)的影響，以全面地了解hnRNP A1和ASF/SF2對(duì)UV

4、B照射的響應(yīng)及其對(duì)腫瘤促進(jìn)的作用。
　　細(xì)胞自噬是UVB照射引起的細(xì)胞反應(yīng)，可以促進(jìn)UVB照射下細(xì)胞的存活，并在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中起重要作用。而目前對(duì)于細(xì)胞自噬與剪接因子之間關(guān)系的研究還沒(méi)有報(bào)道，在本論文中，我們?cè)噲D探究HaCaT細(xì)胞中剪接因子與細(xì)胞自噬之間的關(guān)系，以增進(jìn)剪接因子促癌功能的了解。
　　綜上，本論文主要研究?jī)?nèi)分為三大部分：1.UVB通過(guò)剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2調(diào)控mdm2的可變剪接過(guò)程;2.剪接因

5、子hnRNP A1和ASF/SF2對(duì)于UVB照射下的響應(yīng)及細(xì)胞存活的影響；3.hnRNP A1和ASF/SF2與UVB導(dǎo)致的細(xì)胞自噬之間的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：
　?、賃VB可以促進(jìn)HaCaT細(xì)胞中mdm2基因的可變剪接，促使mdm2B剪接變異體表達(dá)量增加，mdm2-FL下調(diào)。
　?、赨VB照射可以促進(jìn)HaCaT細(xì)胞中hnRNP A1和ASF/SF2的表達(dá)，其中剪接因子hnRNP A1通過(guò)與mdm2 pre-mRNA的直接

6、結(jié)合進(jìn)而調(diào)控UVB引起的mdm2選擇剪接過(guò)程，但是在我們的實(shí)驗(yàn)中，ASF/SF2卻對(duì)mdm2的可變剪接過(guò)程沒(méi)有顯著調(diào)控影響。
　?、踀VB照射引起的HaCaT細(xì)胞中hnRNP A1和ASF/SF2的高表達(dá)具有時(shí)間依賴(lài)性，通過(guò)免疫熒光和western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)UVB照射后，兩個(gè)蛋白可以從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。
　?、芙?jīng)藥物清理ROS，western blot檢測(cè)，證明ROS可以抑制UVB引起的剪接因子hnRNP A1和

7、ASF/SF2的上調(diào)；同時(shí)，通過(guò)瞬時(shí)過(guò)表達(dá)p53，證明p53也是UVB引起的hnRNP A1和ASF/SF2表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子。
　　⑤通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入抑制劑，用western blot檢測(cè)，證明抑制NF-κB與Akt信號(hào)通路可以導(dǎo)致hnRNP A1和ASF/SF2的下調(diào)；但是在加入NF-κB抑制劑后再進(jìn)行UVB照射，仍然可以促進(jìn)hnRNP A1和ASF/SF2水平的上調(diào)，而加入Akt信號(hào)通路抑制劑組再進(jìn)行UVB處理后hnRN

8、P A1和ASF/SF2水平不再上調(diào)，說(shuō)明UVB主要通過(guò)Akt信號(hào)通路調(diào)控hnRNP A1和ASF/SF2的表達(dá)。
　?、抻胹iRNA將hnRNP A1和ASF/SF2水平沉默后檢測(cè)細(xì)胞在UVB照射后細(xì)胞存活率，證明hnRNP A1和ASF/SF2有促進(jìn)UVB照射后HaCaT細(xì)胞存活的功能。
　?、咄ㄟ^(guò)慢病毒構(gòu)建EGFP-LC3B的HaCaT穩(wěn)定細(xì)胞株，構(gòu)建了可以通過(guò)熒光顯微鏡以及western blot方法檢測(cè)的細(xì)胞自噬模