趨化因子CCL2對血小板功能的調(diào)控及其機制研究.pdf

1、急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是嚴重威脅人類健康和生命的重大疾病之一，由于其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率，AMI已成為我國重大的公共衛(wèi)生問題。血小板聚集和活化在AMI斑塊及血栓形成過程中扮演重要角色。近年來，經(jīng)皮冠狀動脈介入聯(lián)合雙聯(lián)抗血小板治療（阿司匹林+氯吡格雷）已成為AMI的主要治療措施之一，不僅能有效緩解AMI患者的臨床癥狀，還能顯著改善患者的預后。然而，4％-30％人群對氯吡格雷的

2、反應性低下甚至無反應，這種現(xiàn)象被稱為氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)，這部分患者發(fā)生心血管事件的風險明顯增加。增加氯吡格雷劑量、使用三聯(lián)的抗血小板藥物（阿司匹林+氯吡格雷+西洛他唑）或使用新型抗血小板藥物替格瑞洛后能有效降低CR患者發(fā)生心血管事件的風險，但并不能完全消除上述事件的發(fā)生，提示CR患者在經(jīng)過優(yōu)化的抗血小板治療后仍然存在一定程度的血小板聚集和活化。因此，從血小板聚集和活化角度入手，尋找對抗血小

3、板功能的關鍵調(diào)控分子及信號通路，可以為AMI等心血管疾病的防治提供新的策略和依據(jù)。
　　為深入明確CCL2對血小板功能的影響，本研究首先檢測CCL2在ST段抬高型心肌梗死患者(ST-elevation myocardial infarction，STEMI)血漿及罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織中的表達。接下來以20例健康志愿者為研究對象，采用RT-PCR、Western Blot、免疫組織化學、免疫熒光染色、光學比濁法、流式細胞術和ELI

4、SA等方法，檢測CCL2對血小板聚集、活化、顆粒分泌和粘附功能的影響，以及PKCα-P38MAPK信號通路在其中發(fā)揮的調(diào)控作用等方面進行研究。本研究通過闡明CCL2對血小板功能的影響及其機制，不僅可能為AMI等心血管疾病的診斷和防治提供依據(jù)，還試圖為尋找新型的抗血小板藥物提供新的靶點和策略。
　　本課題的主要研究內(nèi)容和結果如下:
　　1、CCL2在STEMI患者血漿及罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織的表達顯著高于對照組
　　(1

5、)本部分以40例STEMI患者以及40例年齡與性別相匹配的健康對照為研究對象。分析STEMI組和對照組的臨床基線資料發(fā)現(xiàn)，STEMI組吸煙史比例、高血壓病史比例以及空腹血糖水平均顯著高于對照組(吸煙史:p=0.014;高血壓病史:p=0.004;空腹血糖水平:p=0.003)，其余指標包括BMI和血脂水平等均無明顯的統(tǒng)計學差異。
　　采用ELISA方法檢測CCL2在STEMI患者及對照組血漿中的表達。結果顯示CCL2在STEMI患

6、者血漿的表達顯著高于對照組(299.17±78.73 pg/ml vs.177.00±30.92 pg/ml，n=40，p＜0.01)，具有顯著的統(tǒng)計學意義。
　　(2)應用抽吸導管方法收集10例STEMI患者罪犯冠狀動脈內(nèi)的血栓組織，同時收集上述10例患者非罪犯冠狀動脈內(nèi)的動脈血，體外實驗制備STEMI患者非罪犯冠狀動脈血凝塊作為本部分的對照。采用實時熒光定量PCR、Western Blot、免疫組織化學及免疫熒光染色方法檢測C

7、CL2及受體CCR2在STEMI患者罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織的表達及定位情況。結果提示，在STEMI患者罪犯冠狀動脈的血栓組織中，CCL2及CCR2的mRNA和蛋白水平均顯著高于其自身非罪犯冠狀動脈的血凝塊，具有顯著的統(tǒng)計學意義(n=10，p＜0.01)。同時研究還發(fā)現(xiàn)，在STEMI患者罪犯冠狀動脈的血栓組織中，CCL2及CCR2均能與血小板活化標志物CD62p存在共定位表達。
　　上述結果表明，CCL2在STEMI患者血漿及罪犯冠

8、狀動脈內(nèi)血栓組織的表達顯著高于對照組，提示CCL2在STEMI患者冠狀動脈血栓的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用。
　　2、CCL2促進血小板聚集、活化、顆粒分泌和粘附
　　(1)本部分納入20例健康志愿者，應用CD45+磁珠分離獲得純化的血小板后，采用RT-PCR、Western Blot和免疫熒光染色檢測CCL2的受體CCR2在人血小板上的表達情況。本研究首次證實CCR2在健康人血小板上有明顯表達。
　　(2)以20例健

9、康志愿者為研究對象，用CCL2重組因子刺激血小板后，采用光學比濁法、流式細胞術和ELISA等方法檢測CCL2對血小板聚集、活化、顆粒分泌及粘附功能的影響。與基線組比，CCL2濃度為100 ng/ml時可明顯增加血小板聚集率(15.03±2.44％ vs.6.92±2.12％，n=20，p＜0.01)，隨著CCL2濃度的增加，血小板聚集率也逐漸增加，呈劑量依賴模式。因此，選擇100 ng/ml作為CCL2的后續(xù)實驗濃度。
　　(3)

10、應用CCL2中和抗體或CCR2拮抗劑(RS102895)預處理血小板后，采用光學比濁法、流式細胞術和ELISA等方法檢測兩者對血小板功能的影響。與CCL2組相比，CCL2中和抗體能顯著抑制血小板聚集率(9.33±1.72％，n=20，p＜O.01)、血小板活化指標PAC-1和CD62p的表達(PAC-1:11.58±1.87％; CD62p:5.35±0.53％，n=20，p＜0.01)、血小板顆粒分泌指標CD40L和TXB2的表達(C

11、D40L:87.88±12.01 pg/ml;TXB2:11.77±2.77 ng/ml，n=20，p＜0.01)，以及血小板與內(nèi)皮細胞的粘附(27.25±8.66，n=20，p＜0.01)。
　　(4)在經(jīng)典的血小板誘導劑ADP或Collagen存在時，觀察CCL2與ADP或Collagen對血小板功能的影響是否存在協(xié)同作用。與ADP組相比，CCL2與ADP聯(lián)合作用能更顯著的促進血小板聚集率(60.2±6.06％ vs.43.1

12、5±8.58％，n=20，p＜0.01)、血小板活化標志物PAC-1和CD62p的表達(PAC-1:53.85±7.64％ vs.39.34±5.31％; CD62p:34.77±2.79％ vs.27.56±1.73％，n=20，p＜0.05)、血小板顆粒分泌指標CD40L(425.37±64.58 pg/ml vs.201.61±34.48 pg/ml; n=20，p＜0.01)和TXB2的表達(41.88±5.09ng/ml vs

13、.31.24±6.74 ng/ml, n=20, p＜O.05)。
　　上述結果提示，CCL2能顯著促進血小板聚集、活化、顆粒分泌以及粘附，這些作用可以被CCL2中和抗體或CCR2拮抗劑RS102895所抑制。在對血小板功能的影響過程中，CCL2與ADP或Collagen存在一定的協(xié)同效應。
　　3、PKCα-P38MAPK信號通路介導CCL2對血小板功能的調(diào)控
　　(1)鑒于PKCs、MAPKs和PI3K/AKT信號

14、通路在調(diào)控血小板活化和顆粒分泌等方面的重要作用，采用Western Blot方法檢測CCL2對血小板PKCs、MAPKs和PI3K/AKT信號分子磷酸化水平的影響。結果顯示CCL2顯著增加血小板磷酸化PKCα和P38MAPK的表達(n=5，p＜0.05)，而磷酸化PKCβⅡ、ERK1/2、JNK1/2、PI3K和AKT的表達無明顯改變，總PKCα、PKCβⅡ、P38MAPK、ERK1/2、JNK1/2、PI3K和AKT的表達也無明顯變化

15、。
　　應用CCL2中和抗體和CCR2拮抗劑RS102895預處理血小板后，采用Western Blot方法檢測血小板磷酸化PKCα和P38MAPK的表達水平。發(fā)現(xiàn)CCL2中和抗體和RS102895均能顯著降低血小板磷酸化PKCα和P38MAPK的表達(n=5，p＜0.01)。上述結果表明CCL2可誘導血小板PKCα-P38MAPK通路的活化。
　　(2)應用PKCα抑制劑(RO318220)或P38MAPK選擇性抑制劑(S

16、B203580)預處理血小板后，采用Western Blot方法檢測血小板磷酸化PKCα和P38MAPK的表達。實驗表明RO318220能顯著降低CCL2對血小板磷酸化PKCα和P38MAPK表達的影響;SB203580僅能降低血小板磷酸化P38MAPK的表達，對磷酸化PKCα的表達無影響。
　　上述結果提示，CCL2通過活化PKCα-P38MAPK信號通路來參與對血小板聚集、活化、顆粒分泌及粘附功能的調(diào)控。
　　綜上所述，

17、本課題發(fā)現(xiàn)CCL2在STEMI患者血漿及罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織的表達均顯著高于對照組。體外實驗首先證實CCL2可顯著增加血小板聚集、活化、顆粒分泌以及血小板與內(nèi)皮細胞的粘附，并且PKCα-P38MAPK信號通路在該過程中發(fā)生明顯活化。選擇性阻斷PKCα和P38MAPK信號通路后顯著抑制CCL2對血小板聚集、活化、顆粒分泌和粘附功能的影響，提示CCL2通過活化PKCα-P38MAPK信號通路參與對血小板功能的調(diào)控。本研究初步揭示了CCL2