植物耐鹽相關(guān)基因GarCIPK、SbHKT1的克隆與功能分析.pdf

1、植物在生長發(fā)育過程中經(jīng)常面臨鹽害、干旱、低溫等非生物脅迫，鹽漬作為自然界主要的非生物脅迫之一，是影響農(nóng)作物產(chǎn)量最為嚴重的因素之一。全世界鹽漬土面積約10億hm2，占世界陸地面積的10％，而且在進一步擴大。棉花是世界上重要的纖維作物和油料作物，也是鹽堿地的先鋒作物，但土壤含鹽濃度超過0.3％，棉花的生長發(fā)育便會受到嚴重的影響?，F(xiàn)有的棉花主栽培品種陸地棉耐鹽性總體水平不高，我國棉花的基礎(chǔ)種質(zhì)過于集中造成耐鹽品種遺傳基礎(chǔ)相當(dāng)狹窄，從而使得棉花

2、耐鹽品種的選育難以突破。因此，挖掘一些抗逆基因并進行功能研究，具有重要的意義及應(yīng)用價值，可以為棉花的抗逆轉(zhuǎn)基因育種提供潛在的有效候選基因。
　　 蛋白激酶、K+轉(zhuǎn)運體HKT在植物的抗鹽等非生物脅迫途徑中起著非常重要的作用。本研究從棉屬野生種旱地棉（Gossypium aridum）中克隆了一個受鹽脅迫誘導(dǎo)的蛋白激酶基因GarCIPK，并將此基因轉(zhuǎn)入煙草進行初步的功能分析;將本實驗室前期研究中克隆的海篷子K+轉(zhuǎn)運體SbHKT蛋白基

3、因轉(zhuǎn)入煙草進行功能驗證，并在棉花中進行了轉(zhuǎn)基因研究。
　　 1、GarCIPK基因的克隆與序列分析從本實驗室旱地棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中選擇表達豐度高的一個蛋白磷酸激酶基因片段，利用電子克隆及RT-PCR方法獲得旱地棉的一個蛋白磷酸激酶基因（GarCIPK）。該基因的ORF全長1350bp，編碼449個氨基酸，編碼蛋白大小為51.12 kD，理論等電點為8.13。與擬南芥和水稻中所有已知的CIPK進行氨基酸序列比對分析，一致性分別在25.

4、11％-42.09％之間以及31.66％-73.95％之間。實時熒光定量PCR分析表明該基因在棉花幼苗期有一定的基礎(chǔ)表達，葉片中該基因的相對表達量在鹽處理48h后最大，而在根中處理24h后表達量達最大。該基因組序列不合內(nèi)含子，啟動子序列分析表明GarCIPK基因啟動子區(qū)域包含脅迫應(yīng)答元件（ARE和LTR）、發(fā)育相關(guān)元件(CAT-box)及激素相關(guān)元件（GARE-motif）等調(diào)控結(jié)構(gòu)域。由以上結(jié)果推斷GarCIPK基因可能參與棉花幼苗期

5、對高鹽逆境脅迫的應(yīng)答，并可能在棉花耐鹽性機制中起著重要作用。
　　 2、GarCIPK基因的功能研究分別用CaMV35S啟動子及逆境脅迫誘導(dǎo)啟動子RD29A與GarCIPK構(gòu)建植物表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將基因轉(zhuǎn)入煙草。轉(zhuǎn)基因煙草初步功能驗證表明，在正常條件下的MS培養(yǎng)基上，過表達及逆境誘導(dǎo)表達GarCIPK的轉(zhuǎn)基因株系的根長與野生型對照的沒有顯著差異，而在150mM和200mMNaCl的MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因株系的根

6、長顯著長于野生型對照;對轉(zhuǎn)基因煙草進行PEG干旱模擬試驗，正常條件下的營養(yǎng)液及添加10％PEG的營養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)基因株系與野生型對照沒有差異，而在含20％PEG的營養(yǎng)液中，野生型對照較轉(zhuǎn)基因株系萎焉嚴重。由此說明，轉(zhuǎn)基因植株比對照植株具有較強的耐鹽和抗旱性。
　　 3、SbHKT1基因的功能分析及棉花轉(zhuǎn)化研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將海篷子的高親和K+轉(zhuǎn)運體SbHKT1基因轉(zhuǎn)入煙草，獲得抗性再生植株，通過對T0代再生植株DNA水平PCR檢測