擬南芥氨基脫氧分支酸裂解酶的生物學功能研究.pdf

1、葉酸是指四氫葉酸及其衍生物這一類物質(zhì)，是介導一碳單位轉(zhuǎn)移的重要輔助因子，參與生物體內(nèi)許多重要反應。葉酸分子的化學結(jié)構由三部分組成：喋啶、對氨基苯甲酸(pABA)和谷氨酸鹽。植物中葉酸的合成過程涉及兩個分支：pABA分支和喋啶分支。氨基脫氧分支酸裂解酶(ADCL)在pABA分支中催化氨基脫氧分支酸(ADC)芳香化為pABA。本論文是以突變體Atadcl為材料，分別用基因突變、RNAi、超表達和原核表達的方法來探討擬南芥中氨基脫氧分支酸裂解

2、酶(AtADCL)的生物學功能。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.基因AtADCL在擬南芥生長的各個時期、各個組織中普遍表達。我們從ABRC訂購了T-DNA插入突變體SALK111981。經(jīng)PCR鑒定得到了AtADCL的純合突變體，命名為Atadcl，并分析了基因AtADCL的轉(zhuǎn)錄水平的表達情況。當采用跨T-DNA插入位點的基因特異性引物時突變體Atadcl中該基因的轉(zhuǎn)錄本幾乎檢測不到；當采用不跨T-DNA插入位點的基因特異性引物時

3、突變體中的轉(zhuǎn)錄本豐度與野生型相比明顯下降。突變體Atadcl在營養(yǎng)生長和生殖生長階段與野生型并無明顯差異。統(tǒng)計了不同發(fā)育時期的蓮座葉葉片數(shù)目，發(fā)現(xiàn)突變體與野生型的蓮座葉葉片數(shù)目沒有差異。在黑暗誘導離體葉片凋亡的過程中，突變體與野生型的葉片凋亡速率無明顯差異。生長在正常1/2MS和氮限制培養(yǎng)基上的突變體幼苗的狀態(tài)均比野生型好，而且，RT-PCR分析顯示參與氮代謝途徑中的某些基因在突變體中的轉(zhuǎn)錄本豐度比同樣條件下的野生型中的高。通過微生物法

4、檢測，我們發(fā)現(xiàn)突變體中的總?cè)~酸含量是野生型的134.6％。另外，HPLC-MS/MS分析結(jié)果顯示突變體中的四氫葉酸含量是野生型的179.3％，5-甲基-四氫葉酸含量是野生型的125.2％，5-甲酰-四氫葉酸含量是野生型的114.7％。
　　 2.與野生型相比，基因AtADCL在5個不同的RNAi轉(zhuǎn)基因株系中的轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低，在4個不同的超表達轉(zhuǎn)基因株系中的轉(zhuǎn)錄水平均明顯升高。
　　 3.采用微生物法檢測了突變體、RN

5、Ai和超表達轉(zhuǎn)基因株系的總?cè)~酸含量，我們發(fā)現(xiàn)5個不同的RNAi轉(zhuǎn)基因株系的總?cè)~酸含量與野生型相比均提高，分別是野生型的146.9％、172.2％、136.0％、126.1％和132.0％。四個不同的超表達轉(zhuǎn)基因株系的總?cè)~酸含量與野生型相比也均提高，分別是野生型的184.3％、173.2％、136.8％和144.7％。
　　 4.將AtADCL的CDS序列構建到載體pET30a上，在Rossette(DE3)感受態(tài)細胞中通過IPT

6、G誘導進行重組蛋白的原核表達，然后通過SDS-PAGE分析。結(jié)果表明重組蛋白只在沉淀中表達即以包涵體形式存在。為了檢測AtADCL在擬南芥中是否具有酶學活性，就必須得到可溶性的重組蛋白。我們將AtADCL的CDS序列構建到融合了一段超酸序列的載體pET-YdRb上，并通過IPTG誘導和SDS-PAGE分析，結(jié)果重組蛋白成功地在上清液中表達。接下來，我們將收集大量的可溶性重組蛋白，測定AtADCL在植物體內(nèi)的酶學活性。
　　 以上

7、結(jié)果說明無論T-DNA插入還是RNA干擾都不能阻斷擬南芥中葉酸的合成途徑，而且令我們驚奇的是，突變體和RNA干擾轉(zhuǎn)基因株系中的總?cè)~酸含量與野生型相比均有提高?？赡艿脑蚴牵?)T-DNA插入和RNA干擾并沒有使基因的功能完全沉默，仍然保留一定的酶學活性；2)因為葉酸對植物的生長發(fā)育起著關鍵的作用，而pABA又是葉酸合成的一個前體，所以當基因AtADCL(At5G57850)在植物中突變了，一定有其他基因在起作用，從而保證pABA正常合成