擬南芥懸浮細胞生物學及其遺傳轉化模式.pdf

1、本文從擬南芥懸浮細胞及其愈傷組織生物學特性研究入手，以期制備適合農桿菌高效轉化的受體材料，并制定科學、合理、有效的轉化方案；利用所構成的多個質粒載體，進行擬南芥懸浮細胞基因轉化，以檢驗多種轉化方案的可行性，并優(yōu)化轉化條件；檢測轉化細胞報告基因的瞬時表達和穩(wěn)定表達，以期建立有效的轉化模式，并獲得可利用的轉化材料。本論文所做的主要工作如下： 1、擬南芥懸浮細胞及其愈傷組織生長特性與培養(yǎng)條件 試驗研究了擬南芥懸浮細胞及其愈傷組

2、織的生長特性及其繼代培養(yǎng)條件，旨在摸索維持擬南芥懸浮細胞正常穩(wěn)定生長的培養(yǎng)技術，并為擬南芥懸浮細胞進一步的遺傳操作提供良好的受體材料和科學依據。結果表明，在每個7d一次的繼代周期中，擬南芥懸浮細胞的生長表現(xiàn)明顯的S型生長曲線。正常培養(yǎng)條件下，繼代后2-4d出現(xiàn)快速生長時期，此后生長量迅速下降，但接種量不同，其繼代后懸浮細胞生物量及快速增長發(fā)生時期不同。維持7d繼代周期的理想接種量為起始懸浮液按10ml/50ml稀釋。接種量小，生長遲緩，

3、甚至不能增殖。培養(yǎng)基中不同激素及不同蔗糖含量均會對其生長產生極明顯的影響，在B5+0.2mg/LNAA條件下反復繼代后的細胞，再加入外源NAA時，反而會抑制其生長。蔗糖含量以30g/L最好；蔗糖含量低，懸浮生物量及細胞活性明顯下降。 擬南芥愈傷組織生長也呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，正常條件下，需經歷約各10d的誘導時期、快速生長時期和生長停滯及老化時期。愈傷組織誘導及其生長對外界條件也特別敏感，一定的表面濕度及較低的培養(yǎng)溫度是必須的。

4、 2、擬南芥懸浮細胞及其愈傷組織對抗生素的反應 試驗研究了擬南芥懸浮及其愈傷組織對潮霉素、卡那霉素、頭孢霉素等3種抗生素的反應，為擬南芥懸浮細胞轉化子抗生素選擇濃度和選擇方案的制定提供依據。結果表明：潮霉素對擬南芥懸浮細胞生長、愈傷組織誘導及其生長均有極明顯的抑制作用，但作用效果和特性均有所不同。擬南芥懸浮細胞繼代培養(yǎng)階段、愈傷組織誘導階段和愈傷組織增殖階段的臨界致死濃度分別為25，2.5，1.5mg/L，液體與固體培養(yǎng)條件

5、下差異極大。當采用潮霉素抗性標記篩選轉化子時，應當分別采用相應階段的臨界致死濃度作為轉化子選擇濃度。與此同時，潮霉素需要一定處理時間才能充分表現(xiàn)其抑制細胞生長或殺死細胞的效果，一般液體培養(yǎng)條件下3d以后、固體培養(yǎng)條件下5d以后效果趨于穩(wěn)定，但不同的處理濃度有較大差異，建議選擇時間在液體培養(yǎng)條件下不少于3d，在固體培養(yǎng)條件下不少于5d。否則，假陽性率會很高，從而大大加重后續(xù)轉化子檢測的工作量。 卡那霉素與潮霉素有類似的影響，在愈傷

6、組織誘導階段，適宜的選擇濃度為50mg/L，根據潮霉素作用特性推測，其在液體培養(yǎng)階段和愈傷組織生長階段的適宜選擇濃度分別在100mg/L、25mg/L左右。后續(xù)的轉化試驗中，若利用卡那霉素選擇，我們將采用這一選擇濃度。 試驗中意外發(fā)現(xiàn)頭孢霉素能促進綠色懸浮細胞的獲得，并具有逆轉懸浮細胞“白化”的穩(wěn)定效果。有關懸浮細胞“白化”原因及頭孢霉素逆轉效應機理，有待進一步研究。 3、擬南芥懸浮細胞耐受性試驗 選擇與其遺傳轉

7、化相關的常溫靜置、低溫靜置、高溫振蕩、蔗糖饑餓和常溫振蕩(對照)幾種不同處理方式，從其生長和細胞活性兩個方面，研究其對環(huán)境脅迫的耐受性，以更好地制定擬南芥懸浮細胞基因轉化時細胞同步化或預處理及共培養(yǎng)的方案和條件。結果表明：擬南芥懸浮細胞對各種脅迫處理的耐受性表現(xiàn)出明顯的差異，整體耐受性強弱依次為：常溫振蕩(對照)＞蔗糖饑餓＞高溫振蕩＞低溫靜置＞常溫靜置，常溫靜置最低。擬南芥懸浮細胞對脅迫處理的不適應表現(xiàn)在多個方面，總生物量增長很少或不能

8、增長，細胞相對活性及活細胞生物量不斷下降，耐受系數低。隨著時間的變化，擬南芥懸浮細胞對脅迫處理的耐受性或不適應性的表現(xiàn)呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，這種變化的可能機制與細胞間協(xié)同與競爭、細胞自我適應機制的調節(jié)等有關。 4、擬南芥懸浮細胞超低溫保存試驗 探索一般實驗室條件下擬南芥懸浮細胞的簡便保存技術，為中長期保存遺傳背景穩(wěn)定一致的擬南芥懸浮細胞起始材料提供有效的方法。通過一系列試驗，本文獲得了擬南芥超低溫保存的適宜方法。優(yōu)化方案如

9、下：選擇繼代后2d的擬南芥懸浮細胞，洗滌1次，細胞沉淀重懸浮于6％蔗糖培養(yǎng)基，于4℃低溫下鍛煉6h；濃縮細胞使之有較高的細胞密度(0.25～0.30g/ml)，加入16％(W/V)甘油作為冰凍保護劑，直接置于-80℃深冷冰箱保存；使用時以37℃快速解凍，離心后除去保護劑，然后可用去離子水洗滌后進行活性檢測，也可用基本培養(yǎng)基洗滌后重新進行懸浮培養(yǎng)。此方法保存30d后的細胞相對活性達0.8左右，可以滿足實驗室一般研究用。如果對其保存后的活性

10、要求不很嚴，還可以進一步簡化，例如，預處理前以懸浮細胞自然沉降代替離心洗滌后收集細胞沉淀；免去高滲預處理，直接加入冰凍保護劑后在低溫下鍛煉6h；室溫下解凍等。 5、農桿菌的轉化與制備 對本文擬使用的pBIB/GUS、pBIB/SARs、pBINm-gfp5-ER等幾種質粒載體構建和工程菌制備及其生長特性等進行了系列試驗。通過酶切和PCR檢測實驗，證明所構建的pBIB/GUS、pBIB/SARs載體正確，含有相應的標志基因

11、，可以用于后續(xù)的擬南芥懸浮細胞基因轉化。采用電轉化法，成功地將pBINm-gfp5-ER質粒DNA轉入農桿菌細胞，轉化頻率為2.152×104個/μg質粒，并在一系列檢測實驗中得到證明。擬用的幾種不同質粒具有基本相似但不完全相同的生長特性，而且接種量及培養(yǎng)條件等，對其生長量有很大影響。采用本文方法，成功地制備了可用于植物基因轉化的一系列工程菌株。 6、轉化模式與轉化細胞選擇 比較3種擬南芥懸浮細胞轉化方案，共培養(yǎng)后均獲得

12、GUS的瞬時表達，但僅模式Ⅲ成功地獲得抗性愈傷組織。在模式Ⅲ基礎上，對所獲得的抗性愈傷組織進行二次選擇，發(fā)現(xiàn)一次選擇后的轉化細胞“假陽性”現(xiàn)象十分普遍，推測農桿菌潛伏與爆發(fā)、懸浮細胞存在大量細胞團結構并導致嵌合體形成，是轉化細胞“假陽性”現(xiàn)象的主要原因。預處理方法、靜置共培養(yǎng)時間、恢復培養(yǎng)與液體選擇時間、載體種類等轉化條件對轉化效率有重要影響，以2μmol/L乙酰丁香酮預培養(yǎng)1d、靜置共培養(yǎng)36h、液體選擇培養(yǎng)2d、pBIB/SARs為

13、質粒載體，可以獲得較高的轉化效率，并大大降低假陽性率。對以上條件進行綜合優(yōu)化后，假陽性率從82％降為17％。研究結果表明，在模式Ⅲ基礎上對轉化條件進行適當優(yōu)化，可用于擬南芥懸浮細胞高效轉化。 7、報告基因診斷與分子檢測 對所獲得的抗性愈傷組織進行GUS活性檢測和PCR分析。結果表明：具有GUS活性抗性愈傷組織均擴增出目的基因片段，初步證明，所選擇的74份抗性愈傷組織已成功地轉化。對低溫、高溫、高鹽及對照4種處理后的懸浮細

14、胞進行蛋白質抽提，表明懸浮細胞的蛋白質組與葉片的蛋白質組有很大不同；分別用L-PS10H3和L-PS10AcK14H3作為第一抗體進行蛋白質免疫雜交，表明各處理均不同程度地發(fā)生組蛋白H3磷酸化及乙?；?，但高溫處理降低了磷酸化或乙酰化水平。 8、本文的所取得的重要進展及主要創(chuàng)新點 1)系統(tǒng)研究了擬南芥懸浮細胞及其愈傷組織有關生物學特性、對抗生素的反應和對環(huán)境脅迫的耐受性，不僅積累了這一重要模式植物的細胞生物學資料，同時使其

15、遺傳轉化方案和條件的制定建立在細胞生物學依據之上，為實現(xiàn)擬南芥懸浮細胞高效轉化提供了新的途徑，也為類似轉化系統(tǒng)的建立提供了新的思路。 2)摸索了擬南芥懸浮細胞維持培養(yǎng)的繼代條件，提出“繼代指數”概念，同時建立了擬南芥懸浮細胞理論生長模型，為受體材料的制備提供了科學依據。 3)摸索了擬南芥懸浮細胞在不同培養(yǎng)條件下和不同生長階段對抗生素的反應，使抗生素抗性標記選擇方案更加科學，改善了抗生素選擇效果。 4)檢測或轉化了

16、多種質粒載體系統(tǒng)，建立了不同質粒載體農桿菌的理論生長模型，比較了不同質粒載體農桿菌的生長特性，制備了可用于植物基因轉化的一系列工程菌株。 5)改進和優(yōu)化了擬南芥懸浮細胞遺傳轉化方案及條件，證明所建立的優(yōu)化模式能夠大幅度提高基因轉化效率，促進了擬南芥懸浮細胞高效轉化目標的實現(xiàn)。 6)發(fā)現(xiàn)并證明了頭孢霉素能顯著地促進擬南芥綠色懸浮細胞的獲得，成功解決了懸浮細胞“白化”的技術難題，并且有可能發(fā)掘這一抗生素新的利用途徑。