人Ⅰ型丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶抗體的制備及生物學(xué)特性研究.pdf

1、人Ⅰ型丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是人體內(nèi)一種以磷酸吡哆醛為輔基的氨基轉(zhuǎn)移酶，在體內(nèi)催化氨基在丙氨酸和谷氨酸之間轉(zhuǎn)移，在非必需氨基酸的合成和蛋白質(zhì)分解代謝中起重要的中介作用。臨床上ALT是反應(yīng)肝臟功能的有效指標(biāo)。血清中ALT的活性可有意義地評(píng)估由感染、藥物、酒精及脂肪變性等原因而引起的肝臟損害，對(duì)肝臟疾病的診斷，鑒別診斷及病情和療效的監(jiān)測(cè)方面發(fā)揮著重要作用。目前，ALT在臨床上的檢測(cè)方法是利用血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，在一定條件下催化底物L(fēng)-丙氨酸

2、與α-酮戊二酸生成L-谷氨酸和L-丙酮酸，再針對(duì)該反應(yīng)產(chǎn)物偶聯(lián)一個(gè)指示反應(yīng)，計(jì)算出ALT酶活性濃度。此類(lèi)方法檢測(cè)的均是ALT酶活性濃度而不是血清中ALT的質(zhì)量濃度。酶活性測(cè)定方法影響因素多，易受底物濃度、酶蛋白抑制劑、離子強(qiáng)度、pH、溫度等多種因素的影響，同時(shí)不能有效區(qū)分不同的同功酶，因此有必要建立特異的免疫學(xué)方法來(lái)監(jiān)測(cè)血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶中實(shí)際質(zhì)量，從而更加真實(shí)客觀(guān)地反應(yīng)肝臟功能的損害程度。 目的： 構(gòu)建人Ⅰ型丙氨酸

3、氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT1）的原核表達(dá)載體，用純化的ALT1重組蛋白免疫新西蘭大白兔，制備抗ALT1多克隆抗體，同時(shí)用純化的ALT1重組蛋白免疫Balb/c小鼠，制備特異性針對(duì)ALT1的單克隆抗體，為進(jìn)一步建立ALT1的免疫學(xué)診斷方法和研究ALT1的生物學(xué)作用和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.采用RT-PCR法擴(kuò)增ALT1基因片段，并將其分別克隆到原核表達(dá)載體pET32a（+）和pGEX-4T-2，構(gòu)建人Ⅰ型丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AL

4、T1）的原核表達(dá)載體。 2.將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和Western Blot檢測(cè)，采用親和層析純化融合蛋白。 3.用純化的ALT1重組蛋白免疫新西蘭大白兔，制備抗ALT1的多克隆抗體。 4.用純化的ALT1重組蛋白免疫Balb/c小鼠，制備特異性針對(duì)ALT1的單克隆抗體。 結(jié)果： 1.用RT-PCR方法擴(kuò)增出

5、與預(yù)期大小一致的目的基因片段，目的基因與載體連接后的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定及測(cè)序分析證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.經(jīng)重組表達(dá)純化，獲得了ALT1融合蛋白，其在pET32a（+）/ALT1表達(dá)載體中表達(dá)形式為不溶性包涵體，在pGEX-4T-2/ALT1載體中有少部份以可溶性形式表達(dá)，融合蛋白均能通過(guò)親和層析的方法純化。 3.用純化的ALT1重組蛋白免疫新西蘭大白兔，可制備出特異性針對(duì)ALT1的多克隆抗體。 4.用純化的

6、ALT1可溶性重組蛋白免疫Balb/c小鼠，建立了穩(wěn)定分泌抗ALT1的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為8A9。其抗體亞類(lèi)為IgG2；將8A9細(xì)胞株接種到預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔中制備腹水型ALT1單克隆抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）證明腹水效價(jià)可達(dá)l05；Western Blot結(jié)果鑒定提示該單克隆抗體可以特異性結(jié)合ALT1。 結(jié)論： 經(jīng)基因重組技術(shù)獲得ALT1融合蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了純化，制備了特異性針對(duì)ALT