禾谷鐮刀菌支鏈氨基酸合成基因FgILV5的生物學(xué)功能研究.pdf

1、麥類赤霉病(Fusarium head blight，F(xiàn)HB)是麥類作物（黑麥、青稞、大麥、小麥等）上的一種流行性病害，其病原菌為禾谷鐮刀菌復(fù)合物（Fusarium graminearumcomplex）.在全國各麥區(qū)都有發(fā)生，長江中下游為主要發(fā)生區(qū)。近年來由于秸稈還田等耕作方式的改變和全球變暖等氣候因素的影響，赤霉病還有蔓延到黃淮麥區(qū)的趨勢(shì)。小麥赤霉病不僅給麥類生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)降低籽粒的質(zhì)量。由于病原菌在侵染過程中形成的多

2、種真菌毒素如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和玉蜀黍赤霉烯酮(ZEN)，不但危害人畜健康，對(duì)食品安全也構(gòu)成極大的威脅。目前生產(chǎn)上由于缺乏抗赤霉病的小麥品種，化學(xué)防治仍是控制小麥赤霉病流行的最有效的方法。我國自上世紀(jì)70年代，主要依賴苯并咪唑類（多菌靈）殺菌劑防治小麥赤霉病，由于常年單一用藥，田間多菌靈的抗藥性問題嚴(yán)峻。因此，新型殺菌劑的研發(fā)對(duì)赤霉病的持續(xù)防控起著至關(guān)重要的作用。從農(nóng)產(chǎn)品的安全角度出發(fā)，某些僅存在于真菌、細(xì)菌、藻類和高等植物中

3、，哺乳動(dòng)物中沒有的生物合成途徑成為新型安全藥劑靶標(biāo)研發(fā)的熱點(diǎn)，例如支鏈氨基酸（Branched-chain amino acids，BCAAs）生物合成途徑，BCAAs是一類人體必需氨基酸，人體只能通過外源攝取，缺乏該類氨基酸合成相關(guān)的酶。因此，BCAAs途徑僅存在于細(xì)菌、真菌以及高等植物中，在哺乳動(dòng)物中不存在，這一事實(shí)使得BCAAs合成酶成為研發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物無毒或低毒藥劑的潛在藥靶。
　　本論文以小麥赤霉病的病原菌禾谷鐮刀菌為研究

4、對(duì)象，通過靶向基因敲除與互補(bǔ)技術(shù)對(duì)禾谷鐮刀菌中編碼第二步反應(yīng)的酮酸-還原異構(gòu)酶(keto-acid reductoisomerase，KARI) FgILV5基因的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究，論文結(jié)果將為研發(fā)靶向于BCAAs合成酶的新型安全藥劑提供理論依據(jù)。通過同源比對(duì)，禾谷鐮刀菌FgIlv5與啤酒酵母菌和白色念珠菌中Ilv5的氨基酸同源性分別為72.24％和71.60％。構(gòu)建FgILV5基因的敲除載體，并通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得敲除轉(zhuǎn)化子，RT

5、-PCR和Southern雜交均顯示標(biāo)號(hào)為△FgIlv5-4的轉(zhuǎn)化子為單拷貝原位插入。FgILV5基因敲除突變體在營養(yǎng)匱乏的MM和FGA培養(yǎng)基上不能生長，在完全培養(yǎng)基PDA上氣生菌絲稀疏、菌落變黃、不產(chǎn)紅色素。Realtime-PCR測(cè)定敲除突變體中的紅色素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平僅為野生型菌株的10％。外源添加兩種氨基酸（纈氨酸+異亮氨酸），且最低濃度需達(dá)到1 mM能夠恢復(fù)FgILV5基因敲除突變體的營養(yǎng)缺乏。FgILV5基因的敲除突變

6、體產(chǎn)分生孢子的能力也受到阻滯，外源添加纈氨酸(Valine)和異亮氨酸(Isoleucine)能恢復(fù)分生孢子形成，但其不能在2％蔗糖水中正常萌發(fā)。FgILV5基因的缺失還會(huì)引起突變體對(duì)滲透壓力和氧化壓力的敏感性。在寄主麥穗和非寄主番茄上，敲除突變體的致病力顯著減弱，病斑不能擴(kuò)展;另外一個(gè)重要的表型是FgIL V5基因敲除突變體的DON毒素產(chǎn)生量與野生型菌株相比顯著降低，菌體內(nèi)的多個(gè)毒素合成基因TRI的表達(dá)量也明顯下降。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，