哮喘的免疫調節(jié)以及靶向治療研究.pdf

1、支氣管哮喘是由多種細胞包括氣道的炎癥細胞和結構細胞（如嗜酸粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等）以及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。這種慢性炎癥導致氣道高反應性，通常出現(xiàn)廣泛多變的可逆性氣流受限，并引起反復發(fā)作性的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，多數(shù)患者可自行緩解或經治療后緩解。全世界大約有3億哮喘患，哮喘在全世界的患病率從1％到18％不等，中國約有3千萬哮喘患者，是全球哮喘病死率最高的國家之一。伴隨著全球

2、工業(yè)化的進展以及環(huán)境污染的加重，哮喘的發(fā)病率和病死率一直居高不下。哮喘不僅會對患者甚至社會造成較大的經濟負擔，而且也會嚴重影響患者的生活質量。因此，探索哮喘的潛在發(fā)病機制，并針對性的開創(chuàng)有效的治療策略具有重要的現(xiàn)實意義。
　　傳統(tǒng)觀點認為，輔助性T細胞2型(T help cell2，Th2)相關細胞因子及其所促使的黏液分泌細胞增生、嗜酸性粒細胞浸潤等病理變化參與過敏性哮喘的發(fā)病與維持，并與癥狀嚴重程度呈正相關;相反，輔助性T細胞1

3、型(T help cell，Th1)分泌的γ干擾素(IFN-γ)可以抑制Th2的增殖而發(fā)揮炎癥抑制作用。Th1功能相對抑制、Th2功能相對亢進的Th1/Th2失衡，所導致的IgE合成增加及白介素4（IL-4）、IL-5、IL-13等Th2型細胞因子的產生是哮喘發(fā)病的主要機制，因此，Th1/Th2軸及其失衡被認為與哮喘的發(fā)病和進展關系最為密切。但是這一理論并不能解釋所有類型哮喘的發(fā)病機制。傳統(tǒng)意義上的Th2/嗜酸粒細胞相關因子介導的哮喘，

4、約占哮喘發(fā)病的41％，而發(fā)病機制、病理特征與此不同的非嗜酸性粒細胞型哮喘約占59％，后者很難用Th1/Th2失衡這一觀點解釋。依據(jù)哮喘患者痰液、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)以及支氣管肺組織中浸潤的主要炎癥細胞種類，可將哮喘分為嗜酸性粒細胞型以及非嗜酸性粒細胞型。Th17/IL-17的發(fā)現(xiàn)與研究完善了Th1/Th2軸失衡為哮喘發(fā)病機制這一傳統(tǒng)觀點，Th17細胞及其分泌的IL-17與

5、哮喘，特別是重癥哮喘或激素抵抗型哮喘之間的關系受到越來越多的重視，但是目前關于IL-17在哮喘中的免疫調節(jié)的認識并不統(tǒng)一。基于哮喘患者以及氣道炎癥動物模型的研究證明，慢性氣道炎癥疾病中IL-17通過多種炎癥介質的表達而參與炎癥細胞的遷移與活化，導致炎癥反應的持續(xù)存在;但是也有文獻證實在某些情況下IL-17在哮喘的發(fā)病中起到抑制作用。更為深入的研究IL-17對哮喘發(fā)病的免疫調節(jié)，有助于我們進一步明確哮喘的發(fā)病機制，探索有效的治療策略。

6、r>　　有規(guī)律的吸入低劑量激素治療是目前控制哮喘最理想的一線治療方法，不過也存在約10％哮喘患者需要吸入較大劑量激素，有1％的哮喘患者需要口服激素來控制哮喘發(fā)病，此類哮喘患者存在對激素治療的依賴性。此外，有小部分哮喘患者對高劑量的口服激素產生部分或完全耐藥，或者稱之為激素抵抗。雖然這類患者只占整個哮喘群體的5％-10％，但其所花費的醫(yī)療資源占據(jù)50％左右。激素抵抗哮喘(steroid resistant asthma，SRA)雖所占比例

7、較低，但其急診就醫(yī)率和住院率分別是輕中度哮喘患者的15倍和20倍，是導致哮喘治療費用增加的主要原因之一。通常將誘導痰中的中性粒細胞達到一定水平者，稱之為中性粒細胞型哮喘。關于不同哮喘類型的橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，氣道中以嗜酸性粒細胞聚集為主哮喘患者對于糖皮質激素治療較為敏感;而那些氣道內無嗜酸性粒細胞，甚至可能表現(xiàn)為中性粒細胞增高的患者，往往存在激素治療效果不明顯的情況。因此，探索出有別于的激素的可以有效治療激素不敏感的中性粒細胞型哮喘的治療方

8、法有重要的臨床意義。
　　第一部分 外源性白介素-17抑制骨髓嗜酸性粒細胞分化緩解過敏性氣道炎癥
　　目的：通過骨髓嗜酸性粒細胞分化的角度探討外源性IL-17在過敏性哮喘氣道炎癥發(fā)病過程中的效應及相關機制，同時探索IL-17對嗜酸性粒細胞存活及功能的影響。
　　方法：野生型C57BL/6小鼠構建嗜酸性粒細胞型哮喘模型，氣道滴注外源性的IL-17或IL-17中和抗體。獲取肺泡盥洗液細胞，進行炎癥細胞總數(shù)及分類計數(shù);肺組織

9、制備病理切片評估氣道炎癥細胞浸潤及粘液分泌;ELISA檢測血清炎癥因子表達。流式細胞術(FACS)檢測骨髓嗜酸性粒細胞及其祖細胞(EoP)水平，并了解IL-17對嗜酸性粒細胞凋亡的影響;明確IL-17對骨髓嗜酸性粒細胞分化相關轉錄因子或趨化因子受體表達的影響。體外誘導骨髓嗜酸性粒細胞分化并以IL-17干預，檢測其分化程度、凋亡水平以及分化相關轉錄因子表達。
　　結果：哮喘小鼠氣道滴注外源性IL-17之后，氣道炎癥細胞浸潤減少，骨髓

10、嗜酸性粒細胞分化被抑制，其祖細胞(EoP)形成減少，但是嗜酸性粒細胞的凋亡未被影響。骨髓細胞體外誘導嗜酸性粒細胞分化過程被IL-17抑制，存活水平無變化。體內及體外實驗中，IL-17下調了嗜酸性粒細胞分化相關的GATA-1、GATA-2及CCR3表達，而不是與該類細胞分化相關的細胞因子IL-3、IL-5、GM-CSF。IL-17亦未能影響嗜酸性粒細胞分泌細胞因子的功能。哮喘小鼠氣道滴注IL-17中和抗體之后氣道中的嗜酸性粒細胞募集增加。

11、
　　結論：本部分研究首次證明外源性IL-17緩解哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道高反應性可能是通過對嗜酸性粒細胞分化的抑制，減少了EoP的形成，進而緩解了炎癥部位該類細胞的聚集，而不是通過對嗜酸性粒細胞的存活或者分泌細胞因子功能的影響。本研究也因此強調了在過敏性氣道炎癥中針對于嗜酸性粒細胞的分化抑制可以作為哮喘治療的新的研究方向或策略。
　　第二部分 IL-17通過ROS介導的TGF-β1表達促進慢性氣道炎癥EMT過程
　　

12、目的：探索過敏性氣道炎癥中IL-17對于氣道上皮細胞間充質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)過程的影響極其相關機制，對哮喘的發(fā)病以及進一步的有效治療提供理論依據(jù)。
　　方法：利用野生型與IL-17A(IL-17)敲除小鼠構建慢性氣道炎癥模型。獲取肺泡盥洗液細胞，進行炎癥細胞總數(shù)及分類計數(shù)，肺組織制備病理切片評估氣道炎癥細胞浸潤及粘液分泌;免疫組化檢測肺組織EMT相關蛋白以及氧化應激相

13、關蛋白8-OHdG的表達;ELISA檢測肺組織IL-17及TGF-β1表達并分析其相關性。人支氣管上皮(HBE)細胞培養(yǎng)并以IL-17干預，免疫熒光及Q-PCR檢測EMT標志α-SMA與N-Cadherin表達，F(xiàn)ACS檢測IL-17誘導的ROS水平;通過ROS抑制劑及TGF-β1抑制劑應用明確IL-17、ROS及TGF-β1三者在EMT過程中的關系。
　　結果：IL-17缺失的哮喘小鼠與野生型哮喘小鼠相比，氣道炎癥、粘液分泌、膠

14、原沉積、EMT相關標志物（α-SMA、N-Cadherin）、氧化應激(8-OHdG)表達得到緩解;肺組織IL-17與氣道重構或EMT相關的關鍵細胞因子TGF-β1表達正相關。體外實驗中，IL-17誘導HBE細胞表達α-SMA、N-Cadherin與TGF-β1，同時上調氧化應激ROS形成;TGF-β1抑制劑能夠逆轉IL-17誘導的α-SMA、N-Cadherin表達，而ROS抑制劑則同時會逆轉IL-17誘導的α-SMA、N-Cadhe

15、rin及TGF-β1表達。
　　結論：IL-17缺失的哮喘小鼠氣道炎癥及EMT過程緩解，IL-17通過誘導ROS的過量產生，進而上調TGF-β1的表達，最終促進慢性氣道炎癥中EMT的進展。
　　第三部分 Bcl-2抑制劑靶向誘導粒細胞凋亡緩解激素不敏感型氣道炎癥
　　目的：研究氣道炎癥持續(xù)性存在的潛在機制，并探索出一種有別于激素的能夠通過誘導炎癥細胞凋亡而緩解氣道炎癥，特別是激素治療抵抗的中性粒細胞型氣道炎癥的治療策略

16、。
　　方法：構建嗜酸性粒細胞型及中性粒細胞型哮喘小鼠模型，收集肺泡盥洗液細胞培養(yǎng)，F(xiàn)ACS檢測激素或Bcl-2抑制劑ABT-737或ABT-199對嗜酸性粒細胞及中性粒細胞體外凋亡的影響。免疫組化及免疫熒光檢測哮喘小鼠肺組織及泡盥洗液炎癥細胞上Bcl-2表達水平。野生型及Bcl-2過表達小鼠構建哮喘模型，通過對不同時間點氣道炎癥細胞募集、炎癥因子表達以及氣道高反應性的檢測，明確Bcl-2在炎癥細胞存活和清除過程中的作用。

17、　　結果：激素在體內或體外均可誘導嗜酸性粒細胞的凋亡，而表現(xiàn)出對中性粒細胞的無效。氣道炎癥疾病中，炎癥細胞不但在氣道中募集增加，而且存活時間延長。氣道炎癥模型小鼠肺組織以及泡盥洗液粒細胞上的凋亡抑制蛋白Bcl-2表達增加;Bcl-2過表達小鼠哮喘模型氣道炎癥更為嚴重而且持續(xù)時間延長。Bcl-2的抑制劑ABT-737或ABT-199給予上述兩種哮喘模型小鼠氣道滴注給藥之后，兩種哮喘模型小鼠均表現(xiàn)出氣道高反應性下降，氣道炎癥細胞募集減少，嗜