重組白介素35對小鼠哮喘免疫調節(jié)和治療作用的研究.pdf

1、[背景及目的]:
　　 支氣管哮喘（哮喘）是由多種細胞和細胞因子參與的慢性呼吸道炎癥性疾病，發(fā)病機制仍未完全闡明。臨床主要以藥物控制為主，目前最有效的免疫治療方法為變應原特異性免疫治療，但仍存弊端如超敏反應、變應原的標準化、療程長、次數(shù)多、患者依從性差，從而影響療效。因此尋找更為安全、有效的免疫治療方法是當今變態(tài)反應性疾病防治的熱點之一。
　　 研究表明哮喘發(fā)病與輔助性T細胞1、2(Th1/Th2)的細胞因子失衡、調節(jié)性

2、T細胞(regular T cells，Tregs)及輔助性T細胞17(T help cell17，Th17)/白細胞介素17(IL-17)等異常有關;而白細胞介素35(IL-35)是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，其與Tregs及Th17/IL-17等免疫調節(jié)功能密切相關，通過多種途徑參與哮喘的發(fā)病和調節(jié)，有望成為哮喘的治療新靶點，也已成為近年研究的熱點。研究證實，IL-35能有效增強Treg亞群的功能，并且有效抑制Th17細胞的增殖分化，抑制

3、機體過度的免疫反應，阻止炎癥對機體的免疫損傷等作用，因此我們認為IL-35可能對支氣管哮喘等變態(tài)反應性疾病具有免疫調節(jié)和治療作用。
　　 我們擬通過重組構建小鼠IL-35其真核表達載體，并將其轉染至中華倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)篩選出穩(wěn)定表達IL-35蛋白的細胞株，利用鎳柱(Ni-NTA)純化培養(yǎng)細胞的上清，最后將純化所得有活性的IL-35蛋白腹腔注射干預小鼠哮喘模型，觀察其對小鼠哮喘動物模型激發(fā)后急性發(fā)作、氣道炎癥的影響，希望

4、闡明重組IL-35在過敏性哮喘等變態(tài)性疾病中的免疫調節(jié)作用機制，探討其在變態(tài)反應疾病的免疫治療中的應用前景。
　　 [內容及方法]:
　　 第一部分真核表達質粒pSectag2A-IL-35的構建與表達
　　 從J774細胞中獲得編碼小鼠IL-12的p35亞基（IL-12 p35或p35）和EB病毒誘導基因3(EBI3) cDNA片段，退火獲得Linker，分別插入真核表達載體pSectag2A。重組質粒pSec

5、tag2A-IL-35測序正確后，轉染CHO細胞，反復篩選后獲得高效表達的細胞株，收集上清，濃縮后親和層析獲得純化的重組IL-35蛋白。
　　 第二部分IL-35對小鼠哮喘動物模型的免疫調節(jié)作用
　　 1、建立小鼠哮喘動物模型:SPF級C57BL/6小鼠12只，隨機分為對照組和哮喘組，每組6只。(1)致敏:哮喘組每只小鼠分別于第0和第7d腹腔內注射0.2 mL含10μg卵蛋白(OVA)和2.25mg氫氧化鋁凝膠的生理鹽水

6、(NS);對照組僅予以0.2 mL含2.25 mg氫氧化鋁凝膠的NS。(2)激發(fā):哮喘組于第14～18 d霧化吸入10 mL NS（含5％ OVA），30 min/d，對照組僅吸入10 mLNS。(3)末次霧化24h后以1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死，收集肺泡灌洗液(BALF)和肺組織標本，檢測BALF中淋巴細胞、嗜酸性粒細胞數(shù)目及上清中細胞因子IL-4、IFN-γ的含量;同時肺組織H&E染色檢測炎性細胞浸潤。
　　 2、IL

7、-35對小鼠哮喘動物模型的免疫影響:SPF級C57BL/6小鼠18只，隨機分為3組，A組:正常對照組;B組:哮喘組;C組:IL-35治療組每組6只。(1)致敏:哮喘組及IL-35治療組每只小鼠分別于第0和第7d腹腔內注射0.2 mL含10μgOVA和2.25mg氫氧化鋁凝膠的NS;A組僅予以0.2 mL含2.25 mg氫氧化鋁凝膠的NS。(2)干預:C組于第7～13 d腹腔注射重組IL-35蛋白，10μg/d/mouse。(3)激發(fā):B

8、組及C組于第14～18 d霧化吸入10 mL NS（含5％ OVA），30 min/d，A組僅吸入10 mL NS。(4)檢測:末次霧化24 h后，以1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死，收集BALF和肺組織，分別檢測BALF中淋巴細胞、嗜酸性粒細胞數(shù)目及上清中細胞因子IL-4、IL-17、TGF-β、IFN-γ的含量;同時肺組織H&E染色及免疫組化檢測肺組織中叉狀頭轉錄因子P3(FoxP3)和IL-17蛋白的表達;最后對檢測結果進行分析。

9、
　　 [研究結果]:
　　 1、以J774細胞總RNA為模板，應用RT-PCR克隆EBI3及p35 cDNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在624 bp、576 bp處均可見單一條帶，大小與預計相符合。測序結果與Genbank(NM_015766.2、NM_001159424.1)中公布的序列一致;并通過退火獲得5(1)bp的Linker，與文獻報道一致[19]。
　　 2、將兩者分別通過TA克隆連接至載體pSectag2

10、A中，最后將Linker連接至pSectag2A-EBI3-p35，構建為重組質粒pSectag2A-IL-35，經(jīng)PCR鑒定證實了目的基因的插入，經(jīng)雙酶切鑒定正確，多個引物測序證實讀碼框完整，無移碼突變，重組質粒構建成功;用Fugene9轉染至CHO細胞中，并用Zeocin篩選穩(wěn)轉株，篩選18 d獲得的轉基因細胞CHO/pSectag2A-IL-35，利用鎳柱純化細胞培養(yǎng)上清液，SDS-PAGE在46.3 kDa處可見一條帶，West

11、ern-Blot分析可見同樣大小的特異條帶，且能與組氨酸(HIS)標簽抗體抗或IL-12 p35特異性抗體結合，表明成功建立細胞系CHO/pSectag2A-IL-35，并獲得小鼠IL-35蛋白。
　　 3、成功建立哮喘模型。致敏前后，觀察哮喘組和對照組小鼠的外觀和行為以及對刺激的反應、活動和體重均無明顯差異。激發(fā)后第2d哮喘組小鼠霧化時出現(xiàn)抓鼻撓腮行為，停止霧化后逐漸消失，第4d，哮喘組小鼠霧化時出現(xiàn)或煩躁不安或安靜少動、或呼

12、吸加快加深或點頭呼吸、弓背直立、前肢縮抬、二便失禁和皮毛無光現(xiàn)象。對照組小鼠飲食正常，活動靈敏，皮毛清潔有光澤。末次霧化24 h后收集標本進行檢測，結果顯示，哮喘組較對照組BALF中白細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞比例增加、細胞因子IL-4升高和IFN-γ降低;H&E染色示肺部炎性細胞浸潤增加;這與哮喘患者Th2功能亢進、Th1功能低下的免疫異常相吻合。結果證明成功建立小鼠哮喘模型，并可應用于IL-35對哮喘免疫調節(jié)與治療作用的研究。
　

13、　 4、 IL-35治療后，B組BALF中IL-4、IL-17、TGF-β表達顯著高A組，C組IL-4、IL-17、TGF-β表達水平回降，低于B組，高于A組，而IFN-γ在BALF中的表達與前三者相反，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。H&E染色顯示C組小鼠肺部炎性細胞浸潤較B組明顯下降，高于A組主要以嗜酸性粒細胞為主，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。免疫組織化學結果顯示，C組FoxP3陽性細胞數(shù)最低，與文獻[17]報道的IL

14、-35誘導型調節(jié)型T細胞（iTr35）不表達FoxP3相一致;B組的IL-17陽性表達顯著升高，高于A組和C組。結果示，經(jīng)腹腔注射重組IL-35，可顯著抑制哮喘動物模型的氣道炎癥，并可上調Tregs增殖分化、抑制IL-17的表達，表明重組IL-35對小鼠哮喘具有免疫調節(jié)和治療作用。
　　 [結論]:
　　 1、通過PCR調取IL-35基因，利用分子克隆技術插入pSectag2A分泌型表達質粒中，成功構建了pSectag2