文昌魚（Branchiostoma belcheri）體內(nèi)細菌清除機制及免疫致敏作用研究.pdf

1、文昌魚屬于脊索動物門，頭索動物亞門，是與脊椎動物親緣關(guān)系最接近的無脊椎動物，一直被認為是研究脊椎動物起源和進化的模式生物。近年來，人們開始在文昌魚中探索免疫系統(tǒng)的起源和進化。本文通過細菌感染文昌魚，研究了文昌魚清除體內(nèi)細菌的免疫機制，并通過熒光實時定量PCR技術(shù)對文昌魚的補體關(guān)鍵基因表達模式以及是否存在免疫致敏作用作了研究。 首先，通過用綠色熒光蛋白標記的大腸桿菌感染文昌魚，將文昌魚切成小段把體液涂抹于載玻片上，在熒光顯微鏡下

2、觀察體液中細菌，證明文昌魚能有效清除入侵的異源微生物。這是在頭索動物中關(guān)于體內(nèi)細菌清除的首次報道。血細胞的吞噬作用被認為是無脊椎動物清除細菌的最重要途徑。我們通過組織切片法在文昌魚體內(nèi)尋找包含大腸桿菌的細胞，至少在2000條文昌魚中都沒有發(fā)現(xiàn)任何吞噬有大腸桿菌的細胞，表明文昌魚既使具有自由循環(huán)的巨噬細胞，也不是其清除入侵大腸桿菌的主要因素。而體液可能是清除細菌的主要成分，為了確定文昌魚體液中哪些成分參與了細菌清除作用，我們通過體外殺菌來

3、分析。提取文昌魚體液，把細菌加入其中，然后于不同時間取樣涂布平板，進行菌落計數(shù)。發(fā)現(xiàn)體液對大腸桿菌具有較強的殺滅活性。通過特異性抗體抑制發(fā)現(xiàn)補體和溶菌酶是參與文昌魚體液殺菌作用的重要體液因子。相比之下，補體較溶菌酶作用更強。為進一步確定哪些補體激活途徑參與了文昌魚體液的殺菌作用，通過分別抑制特定的補體途徑，進而比較體液殺菌活性變化的方法，發(fā)現(xiàn)主要是通過替代途徑激活參與細菌清除作用。Western blot結(jié)果顯示大腸桿菌感染后，文昌魚體

4、液中C3和溶菌酶水平均有明顯升高，進一步證明，補體和溶菌酶確實是參與文昌魚體內(nèi)細菌清除的主要因子。 其次，用大腸桿菌和鰻弧菌持續(xù)感染文昌魚，在感染后的不同時間段取材，分別提取去腸魚和腸組織的RNA，運用熒光實時定量PCR技術(shù)研究補體系統(tǒng)關(guān)鍵基因的表達模式。研究發(fā)現(xiàn)文昌魚對大腸桿菌和弧菌兩種革蘭氏陰性菌的反應(yīng)性基本一致，補體基因的表達規(guī)律非常類似。兩種細菌感染文昌魚后，與正常對照組相比，Bf、C3及C6三基因都存在不同程度的上調(diào)

5、。大腸桿菌感染后，腸中的表達在3h就達到最高值，而去腸魚中的表達在感染后的6h達到峰值。鰻弧菌感染后，腸中的表達在6h時上調(diào)最為顯著，而去腸魚中的表達在感染后的12h達到最高。這表示這些基因在文昌魚感染的急性階段可能發(fā)揮重要作用。有趣的是，MASP在感染后表達降低，這可能是細菌逃避機體補體系統(tǒng)殺傷，維護自身的一種機制。Bf、C3及C6三基因在腸中的總體表達水平，均高于在去腸魚中的表達，達到峰值的時間均比在去腸魚中的提前。MASP在感染后

6、，腸中表達的下調(diào)倍數(shù)也比在去腸魚中的高。這說明文昌魚的消化系統(tǒng)可能是參與免疫的重要的器官，在清除外來微生物的免疫應(yīng)答中起著重要作用。 最后，分別用大腸桿菌和鰻弧菌對文昌魚進行二次感染或交叉感染，運用realtime RT-PCR技術(shù)對補體四個基因的表達模式進行分析，以研究文昌魚的免疫系統(tǒng)是否具有免疫致敏作用。發(fā)現(xiàn)用同一種細菌二次感染后補體基因Bf、C3和C6的表達上調(diào)均比首次感染后顯著，達到峰值的時間都明顯提前，而且表達水平能

7、較長時間維持在一個較高的水平。同樣，在兩種細菌交叉感染實驗中，二次感染后基因表達上調(diào)明顯，但與同種細菌感染兩次相比，基因的上調(diào)倍數(shù)還是略低。所有這些特點與脊椎動物的免疫致敏作用類似，證明文昌魚免疫系統(tǒng)可能存在免疫致敏作用。 總之，本實驗表明缺乏自由循環(huán)的血細胞的文昌魚能夠有效清除入侵的大腸桿菌。補體和溶菌酶是參與體內(nèi)細菌清除的主要因子，但補體的作用較溶菌酶更強。這是關(guān)于文昌魚清除體內(nèi)細菌機制及其相關(guān)因子的首次報道。通過熒光實時