一株藏紅花內(nèi)生真菌多糖的結(jié)構(gòu)及其抗腫瘤、免疫活性研究.pdf

1、真菌多糖作為天然活性生物大分子，在生物醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注。藏紅花在抗腫瘤，增強(qiáng)免疫力，降血脂，抗高血壓，抗抑郁，抗炎等都很好的藥理活性。已有研究表明藏紅花多糖不僅對人子宮癌HeLa細(xì)胞有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，還能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活性。但是藏紅花是柱頭入藥，且栽培條件很難控制，因此產(chǎn)量很低，滿足不了市場的需求。前期基礎(chǔ)工作已經(jīng)通過活性篩選發(fā)現(xiàn)藏紅花內(nèi)生真菌CSL-27多糖有很強(qiáng)的抗氧化活性和良好的抗腫瘤活性。因此本文系統(tǒng)地

2、對該多糖的提取、分離、純化及其結(jié)構(gòu)片段、生物活性等進(jìn)行研究。主要研究包括：
　　第一部分：利用響應(yīng)面法結(jié)合星點設(shè)計考察藏紅花內(nèi)生真菌CSL-27多糖的醇沉提取工藝。首先進(jìn)行單因素實驗，以多糖得率為指標(biāo)，分別對醇沉?xí)r間，醇沉溫度，最終pH和液料比進(jìn)行考察，得到醇沉?xí)r間16 h，醇沉溫度4 ℃，最終pH7和液料比（95％乙醇與發(fā)酵液的體積比）為4:1(L/L)，以此條件為星點設(shè)計的中心點設(shè)置三個水平，再結(jié)合響應(yīng)面法進(jìn)行試驗分析。得到最

3、佳醇沉條件為醇沉?xí)r間16 h，醇沉溫度3.7 ℃，最終pH7.2和液料比為5:1(L/L)并進(jìn)行驗證實驗，多糖得率為162μg/L，與預(yù)測值165μg/L相近，說明該工藝能有效提高多糖的提取率，為多糖深入研究提供基礎(chǔ)。
　　第二部分：運用柱層析分離純化藏紅花內(nèi)生真菌CSL-27多糖以及化學(xué)結(jié)合儀器的方法研究多糖的理化性質(zhì)和EPS-2的結(jié)構(gòu)。藏紅花內(nèi)生真菌CSL-27多糖溶液，先經(jīng)Sevag試劑脫蛋白，大孔樹脂AB-8脫色，透析和凍

4、干等步驟處理后，再用DEAE-52纖維素柱層析分離，得到兩個多糖片段EPS-1和EPS-2，最后兩個多糖片段再經(jīng)葡聚糖凝膠G-75柱層析洗脫后曲線為單一對稱峰。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，苯酚硫酸法測得EPS-1和EPS-2的糖含量為46.60%和28.89%。高效液相色譜分析法測定EPS-1的單糖組成，含有甘露糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，對應(yīng)的比例是2.3:1.0:1.1:1.4；EPS-2的單糖組成含有甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖，對應(yīng)的

5、比例是9.2:6.4:1.0。高效液相凝膠排阻色譜出峰分布均一，表明多糖EPS-1和EPS-2都為均一多糖，分子量分別為29409和40427。EPS-2的紫外光譜顯示在260nm和280 nm處均無吸收峰，說明不含核酸和蛋白。紅外光譜分析結(jié)果表明，EPS-2在3367cm-1,2939 cm-1,1131cm-1和1056cm-1處的吸收峰均是多糖的特征吸收峰，結(jié)構(gòu)中可能含有β-D-吡喃環(huán)和α-糖苷鍵。掃描電鏡顯示 EPS-2表面凹凸

6、不平，有大量褶皺及空隙存在，這些都說明 EPS-2結(jié)構(gòu)的復(fù)雜。GC-MS分析得到四個不同類型的糖殘基片段，分別為1→6)-β-D-葡萄糖、1→)-α-L-阿拉伯糖、1→2,4)-α-D-甘露糖和1→)-α-D-甘露糖，對應(yīng)摩爾比例為6.25:1.00:4.47:6.32。最后結(jié)合核磁共振波譜確定片段的連接順序，得到重復(fù)單元結(jié)構(gòu)的主鏈由1→6)-β-D-葡萄糖，1→2,4)-α-D-甘露糖組成，支鏈由1→)-α-L-阿拉伯糖和1→)-α-

7、D-甘露糖組成。
　　第三部分：利用MTT法體外評價多糖EPS-2的抗腫瘤活性和免疫活性。通過考察多糖EPS-2分別對人慢性髓原白血病K562細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞、人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞和宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制作用來評價其抗腫瘤活性。實驗結(jié)果顯示在劑量濃度(0~5 mg/mL)范圍內(nèi)，EPS-2對K562，HL-60和A549三株細(xì)胞的增殖無顯著的抑制作用，而在0.5 mg/mL時對HeLa細(xì)胞的增殖就具有一定的抑制作

8、用。與前期工作的藏紅花內(nèi)生真菌CSL-27多糖的抗腫瘤活性結(jié)果存在差異的原因，可能是多糖中的色素和EPS-1對其抗腫瘤活性也有一定的作用。巨噬細(xì)胞作為免疫效應(yīng)細(xì)胞在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，因此可通過研究多糖EPS-2對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7的促增殖活性來評價EPS-2的免疫活性。實驗結(jié)果表明在劑量濃度(0~5 mg/mL)范圍內(nèi)，EPS-2對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞都沒有促增殖活性，免疫活性低，可能是EPS-2不