組蛋白去乙酰化酶Rpd3對橘青霉美伐他汀生物合成和生長發(fā)育的調(diào)控.pdf

1、背景：近年來，全基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展使人類能夠在分子水平上對微生物有一個更加深入的認(rèn)識。研究發(fā)現(xiàn)，許多次級代謝產(chǎn)物生物合成基因大都聚集排列成簇存在，這些基因簇的轉(zhuǎn)錄表達(dá)不僅受到全局性調(diào)控蛋白的影響，還與途徑特異性調(diào)控因子和染色質(zhì)介導(dǎo)的調(diào)控有關(guān)。染色質(zhì)介導(dǎo)的調(diào)控通過表觀遺傳對組蛋白進(jìn)行修飾如甲基化、組蛋白乙?；?、磷酸化、泛素化等改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象，促進(jìn)或抑制一些 DNA與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，來實(shí)現(xiàn)激活或沉默一些基因簇的表達(dá)。近年來，以組蛋白

2、去乙?；笧榘悬c(diǎn)進(jìn)行微生物育種越來越受到研究者的歡迎，對組蛋白去乙?；富蜻M(jìn)行分子遺傳操作或通過化學(xué)小分子抑制劑作用于去乙?；?，來改變組蛋白乙?；腿ヒ阴；瘎討B(tài)平衡，這樣不僅可以讓真菌次生代謝行為發(fā)生明顯變化，提高多種已知代謝產(chǎn)物生物合成基因表達(dá)，還能激活沉默基因簇，產(chǎn)生新的化合物。絲狀真菌橘青霉(Penicillium citrinum)作為一種重要的藥用微生物，其代謝產(chǎn)物美伐他汀和橘霉素在人們生活中發(fā)揮著重要作用。美伐他汀是降血

3、脂藥物普伐他汀的前體，具有較好的藥用開發(fā)價值。本實(shí)驗(yàn)室對橘青霉全基因組進(jìn)行了測序并初步分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：橘青霉基因組中存在54個次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，其中聚酮類化合物(PKS)14個，非核糖體多肽類(NRPS)17個，萜類(Terpenes)8個，其它類11個，目前報道的只有美伐他汀生物合成基因簇。組蛋白去乙?；感蛄衧cRpd3、scHda1以及scSir2是當(dāng)前人們對去乙酰化酶分類的主要參考序列，均來自于釀酒酵母，通過本地blas

4、t分析，我們發(fā)現(xiàn)橘青霉中與之同源的蛋白序列分別是Pci-Rpd3為57.9％、Pci-Hda1為54.9%以及Pci-Sir2為50%。這些組蛋白去乙?；甘欠駞⑴c橘青霉次級代謝和生長發(fā)育具有重要研究意義。
　　目的：結(jié)合化學(xué)小分子抑制劑丁酸鈉(SB)、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)和分子遺傳學(xué)手段對橘青霉組蛋白進(jìn)行表觀遺傳修飾，靶向改變表觀遺傳酶類的表達(dá)，探究組蛋白去乙?；富騬pd3對橘青霉美伐他汀產(chǎn)量生物合成和生長發(fā)育的影

5、響，為研究絲狀真菌次級代謝產(chǎn)物的表觀遺傳調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：⑴采用96孔板稀釋法檢測小分子抑制劑SB和SAHA的最低抑菌濃度，然后設(shè)置濃度梯度在PGA培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，第八天后對發(fā)酵液進(jìn)行處理，通過HPLC進(jìn)行檢測，觀察美伐他汀產(chǎn)量的變化。⑵選擇化學(xué)小分子抑制劑的一個最適濃度，檢測在小分子抑制劑作用下橘青霉菌落形態(tài)、菌絲發(fā)育及菌體干重的變化，通過RT-qPCR檢測橘青霉無性生殖相關(guān)基因abaA和brlA和美伐他汀生物

6、合成相關(guān)基因mlcB和mlcR轉(zhuǎn)錄水平的變化。⑶對橘青霉全基因組測序，通過本地blast、NCBI等軟件分析橘青霉組蛋白去乙?；?，采用RT-qPCR檢測并比較小分子抑制劑作用下橘青霉組蛋白去乙酰化酶基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。⑷克隆組蛋白去乙酰化酶基因rpd3全長，通過酶切、純化和連接等分子操作構(gòu)建 pGiHTGi-rpd3重組載體。然后將重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium) LBA4404中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建 O

7、E::rpd3菌株，并經(jīng)抗性平板和PCR進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子篩選。⑸在PGA培養(yǎng)基中對橘青霉野生型和OE::rpd3菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，第8天后對發(fā)酵液萃取處理進(jìn)行HPLC檢測，觀察美伐他汀產(chǎn)量的變化；與野生型對比觀察菌落形態(tài)、菌絲生長、孢子產(chǎn)量的變化。利用RT-qPCR檢測橘青霉無性生殖和美伐他汀生物合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平，從而探究組蛋白去乙?；富?rpd3對橘青霉次級代謝產(chǎn)物和生長發(fā)育的影響。
　　結(jié)果：①通過96孔板稀釋法測得SB

8、作用下橘青霉MIC值為50mM，當(dāng)SB濃度≤0.05mM，美伐他汀的產(chǎn)量與空白組相比無明顯變化；當(dāng)SB濃度≥25mM時，美伐他汀的產(chǎn)量急劇下降；其中在1 mM SB作用下，美伐他汀產(chǎn)量最大為61.485±1.735 mg/L，空白組產(chǎn)量為55.437±1.233 mg/L，較空白組增加了10.91%。②SAHA作用下橘青霉MIC值為250μM，當(dāng)SAHA濃度＜0.005μM時，美伐他汀的產(chǎn)量趨于平穩(wěn)，與空白組無明顯差別；當(dāng)SAHA濃度＞

9、1.00μM時，美伐他汀產(chǎn)量迅速下降；當(dāng)SAHA濃度為0.01μM時，美伐他汀產(chǎn)量達(dá)到最大60.692±1.579 mg/L，空白組產(chǎn)量為51.496±1.07 mg/L，較空白組增加了19.74%。③RT-qPCR檢測，與空白組相比，在1 mM SB作用下，美伐他汀生物合成相關(guān)基因mlcR，mlcB的相對表達(dá)量上調(diào)約為190%和140%；與無性生殖相關(guān)的基因abaA，brlA表達(dá)量上調(diào)約為127%和101%；當(dāng)SAHA濃度為0.01μ

10、M時，美伐他汀生物合成相關(guān)基因mlcR，mlcB的表達(dá)量是對照組的3.61倍和4.09倍；無性生殖相關(guān)基因abaA，brlA的表達(dá)量約為對照組的1.66倍和2.25倍。1 mM SB和0.01μM SAHA作用橘青霉，組蛋白去乙酰化酶基因rpd3、hda1轉(zhuǎn)錄水平受到抑制且對 rpd3的轉(zhuǎn)錄抑制效果較為明顯，其相對表達(dá)量分別為0.732±0.089和0.231±0.004，與空白組相比明顯下調(diào)了，但sir2的轉(zhuǎn)錄水平則變化不大。④成功構(gòu)

11、建 pGiHTGi-rpd3重組載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入橘青霉并篩選得到rpd3過表達(dá)菌株OE::rpd3。⑤通過在PGA培養(yǎng)基中發(fā)酵，與野生型對比rpd3過表達(dá)株美伐他汀產(chǎn)量大幅下降，約為野生型的1/2；生長發(fā)育與野生型對比，OE::rpd3菌株生長發(fā)育明顯滯后；RT-qPCR檢測后，與野生型相比，OE::rpd3菌株美伐他汀生物合成途徑轉(zhuǎn)錄因子mlcR在48 h和72 h的相對表達(dá)量分別下調(diào)10.33%和65.46%；美伐

12、他汀生物合成基因mlcB在36 h、48 h和72 h的相對表達(dá)量分別下調(diào)65.75%、48.16%和49.31%。無性生殖相關(guān)基因abaA在36 h、48 h和72 h的相對表達(dá)量分別下調(diào)54.91%、94.75%和23.48%；brlA在36 h、48 h和72 h的相對表達(dá)量分別下調(diào)88.93%、74.54%和5.92%。橘青霉OE::rpd3菌株全局性調(diào)控因子LaeA的轉(zhuǎn)錄也受到一定的抑制作用，在48 h和72 h的相對表達(dá)量約

13、為野生型的1/2和1/3。
　　結(jié)論：化學(xué)小分子抑制劑在一定的濃度范圍內(nèi)能夠影響橘青霉主要次級代謝產(chǎn)物美伐他汀的生物合成和無性生殖，并表現(xiàn)出促進(jìn)的作用。在1 mM SB作用下，美伐他汀產(chǎn)量較野生型增加10.91%；當(dāng)SAHA濃度為0.01μM時，美伐他汀產(chǎn)量提高了19.74%。將橘青霉組蛋白去乙?；富騬pd3過表達(dá)后，美伐他汀產(chǎn)量大幅下降，產(chǎn)量約為野生型的1/2，其生長發(fā)育出現(xiàn)明顯的滯后。橘青霉組蛋白去乙?；富騬pd3對美