組蛋白去乙?；{(diào)控軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)的機(jī)理研究.pdf

1、【背景】骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病。目前，OA的病因、發(fā)病機(jī)制至今尚不十分明確?，F(xiàn)有研究表明 OA的發(fā)生與年齡、性別、肥胖、關(guān)節(jié)對(duì)線不良或損傷、遺傳及關(guān)節(jié)部位等均有一定關(guān)系，因此對(duì)其治療缺乏明確的針對(duì)性。炎癥因子誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞去分化，細(xì)胞外基質(zhì)的改變特別是II型膠原（COL-Ⅱ）表達(dá)水平下降是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨變性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞去分化，從而維持軟骨細(xì)胞表型可能成為治療OA的一個(gè)

2、有效途徑。
　　組蛋白乙?；钦{(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的一種重要的表觀遺傳修飾方式。組蛋白乙?；接山M蛋白乙酰化酶(HATs)和組蛋白去乙?；?HDACs)共同調(diào)節(jié)。組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi）通過(guò)抑制HDACs而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控。目前HDACi主要用于治療癌癥和神經(jīng)退行性疾病，因其表現(xiàn)出較好的治療效果和較少的毒副作用，開(kāi)始逐漸應(yīng)用治療其他疾病。HDACi作為潛在的抗炎免疫藥物在關(guān)節(jié)炎中的治療作用也越

3、來(lái)越受到人們的關(guān)注。已有研究表明，組蛋白去乙?；閷?dǎo)的基因表達(dá)參與調(diào)控軟骨細(xì)胞表型；另一方面，Wnt-5a可抑制COL-Ⅱ的表達(dá)從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞去分化。
　　本研究通過(guò)建立關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型，檢測(cè)組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA對(duì)Wnt-5a、COL-Ⅱ、SOX-9基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步抑制Wnt-5a觀察TSA對(duì)COL-Ⅱ表達(dá)水平的影響，從而探討HDAC調(diào)控軟骨細(xì)胞去分化的分子機(jī)制。
　　【方法】從OA患者關(guān)節(jié)軟骨分離

4、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)建立軟骨細(xì)胞去分化模型，TSA(0.25uM、0.5uM、1.0uM)分別刺激軟骨細(xì)胞6h、12h、24h，DMSO作為對(duì)照組。提取RNA，硝酸還原酶法（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)COL-Ⅰ、COL-Ⅱ、SOX-9、Wnt-5a的mRNA表達(dá)水平。進(jìn)一步用Wnt-5a抑制劑處理軟骨細(xì)胞，檢測(cè)COL-Ⅱ的表達(dá)情況。
　　【結(jié)果

5、】
　　1．軟骨細(xì)胞體外單層培養(yǎng)時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)和傳代次數(shù)增加，軟骨細(xì)胞COL-Ⅱ表達(dá)水平降低，軟骨細(xì)胞發(fā)生去分化。
　　2．TSA抑制 COL-Ⅱ表達(dá)，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞發(fā)生去分化和表型喪失。
　　3．TSA促進(jìn)Wnt-5a和SOX-9表達(dá)。
　　4.抑制Wnt-5a后，TSA對(duì)COL-Ⅱ表達(dá)的抑制效應(yīng)降低。
　　【結(jié)論】
　　1.利用TSA抑制組蛋白去乙酰化，通?？梢约せ罨虮磉_(dá)。然而，本研究發(fā)現(xiàn)T

6、SA反而抑制COL-Ⅱ的表達(dá)，推測(cè)其它的轉(zhuǎn)錄因子可能參與TSA對(duì)COL-Ⅱ的表達(dá)調(diào)控。
　　2.已有研究表明Wnt5a抑制COL-Ⅱ的表達(dá)，本研究發(fā)現(xiàn)TSA促進(jìn)Wnt-5a表達(dá)，推測(cè)TSA對(duì)COL-Ⅱ的作用可能是通過(guò)升高Wnt-5a表達(dá)水平，激活Wnt-5a信號(hào)通路，從而抑制COL-Ⅱ的表達(dá)。
　　3.進(jìn)一步利用Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑FH535刺激軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制Wnt-5a/β-catenin信號(hào)通路，

7、可以解除TSA的對(duì)COL-Ⅱ的抑制作用。
　　4. TSA促進(jìn)SOX-9的表達(dá)，而已有研究表明SOX-9過(guò)表達(dá)抑制單層培養(yǎng)軟骨細(xì)胞COL-Ⅱ的表達(dá)，因此推測(cè)TSA很有可能通過(guò)升高SOX-9的表達(dá)水平從而抑制COL-Ⅱ的表達(dá)。
　　總結(jié)：TSA抑制COL-Ⅱ的具體機(jī)制是通過(guò)激活Wnt-5a和SOX-9介導(dǎo)抑制 COL-Ⅱ，從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞表型喪失。反之，組蛋白去乙?；赡芡ㄟ^(guò)降低Wnt-5a和SOX-9，從而升高COL-Ⅱ的表