幾丁質(zhì)及高附加值產(chǎn)物酶法生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、幾丁質(zhì)是自然界產(chǎn)量?jī)H次于纖維素的可再生性多聚物。自然界在不斷產(chǎn)生大量幾丁質(zhì)的同時(shí)，微生物也合成了大量能夠降解幾丁質(zhì)的不同性質(zhì)的酶。幾丁質(zhì)在自然界的廣泛分布，意味著能夠分解利用幾丁質(zhì)及其類似物的微生物也有著廣泛的分布。環(huán)境的多樣性、微生物種類的多樣性為人類篩選不同性質(zhì)不同要求的幾丁質(zhì)及其衍生物降解酶提供了可能性。
　　近年來(lái)幾丁質(zhì)及其脫乙?；a(chǎn)物殼聚糖和他們的寡糖，幾丁寡糖和殼寡糖，在諸如食品、制藥、材料科學(xué)、微生物學(xué)、組織工程、納

2、米材料等很多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。因此對(duì)幾丁質(zhì)及其相關(guān)產(chǎn)物形成巨大的需求，但是目前無(wú)論幾丁質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)，還是幾丁質(zhì)脫乙?；a(chǎn)殼聚糖或生產(chǎn)幾丁寡糖、殼寡糖，均以化學(xué)方法為主，幾乎都要用到強(qiáng)酸強(qiáng)堿，對(duì)環(huán)境造成極大的污染。因此迫切需要開發(fā)新的綠色生產(chǎn)工藝。
　　采用生物學(xué)或酶學(xué)方法制備幾丁質(zhì)、殼聚糖及其寡糖具有生產(chǎn)條件溫和可控，對(duì)環(huán)境污染少的優(yōu)點(diǎn)，因此是替代化學(xué)方法的理想技術(shù)，也是目前的研究重點(diǎn)。目前幾丁質(zhì)的生產(chǎn)主要是從蝦蟹殼中采用鹽

3、酸和氫氧化鈉分別脫除碳酸鈣和蛋白質(zhì)的辦法，盡管有了一些改進(jìn)，但是仍需要使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿。另一方面，科研人員從自然界，特別是海洋環(huán)境中已經(jīng)篩選出很多和幾丁質(zhì)分解有關(guān)的酶，如幾丁質(zhì)酶（EC3.2.1.14）、幾丁質(zhì)脫乙?；?CDA;EC3.5.1.41)和殼聚糖酶(EC3.2.1.99)等，但是都普遍都存在酶活力不夠高和酶產(chǎn)量低的問題，因此多處于實(shí)驗(yàn)室階段，尚未應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)?；诖?，本研究首先嘗試采用蛋白酶和有機(jī)酸分別脫除蝦殼中蛋白質(zhì)和碳

4、酸鈣的辦法生產(chǎn)幾丁質(zhì)，然后從與海洋環(huán)境差異巨大的秦嶺山區(qū)不同生境中采集土樣，從中分離新型幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)脫乙酰酶高產(chǎn)菌株，并對(duì)其培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。
　　本研究嘗試采用檸檬酸脫鈣、胃蛋白酶去除蛋白質(zhì)的工藝從蝦殼中提取幾丁質(zhì)。首先以灰分的含量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)確定檸檬酸濃度和處理時(shí)間的最佳參數(shù)，即濃度12％的檸檬酸溶液處理13小時(shí)。該處理得到的幾丁質(zhì)灰分含量為1.5%，達(dá)到工業(yè)級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)（≤3%），接近食品級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（≤1%）。

5、胃蛋白酶去除蝦殼中蛋白質(zhì)的研究中，采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。在考察胃蛋白酶的用量（U/g）、時(shí)間（h）、溫度（℃）和pH等單因素基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化方法的Box-Behnken設(shè)計(jì)，以脫除蛋白質(zhì)的量為響應(yīng)值，構(gòu)建了酶的用量、時(shí)間和溫度的三維響應(yīng)曲面模型。ANOVA分析和實(shí)際驗(yàn)證證明該模型準(zhǔn)確可靠。通過該模型推測(cè)出最佳處理參數(shù)為胃蛋白酶使用量為700 U/g、反應(yīng)溫度36.09℃和反應(yīng)時(shí)間5h，蛋白質(zhì)的脫除率達(dá)到8.47%，占總蛋

6、白質(zhì)含量的27.89%，。蛋白質(zhì)去除率偏低，推測(cè)與蝦殼幾丁質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)。可以通過先脫鈣再脫蛋白或者進(jìn)行兩次脫鈣和脫蛋白的方法提高蛋白質(zhì)的去除效果。
　　優(yōu)良的菌種是微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，一直是微生物降解幾丁質(zhì)研究的重要內(nèi)容之一。但目前篩選到的幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)脫乙酰酶生產(chǎn)菌株均存在酶活力不夠高和穩(wěn)定性差的問題，因此仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，距離工業(yè)化應(yīng)用還有很大的差距。本研究從秦嶺山脈采集土壤樣品，經(jīng)過富集培養(yǎng)后，從中篩選幾丁質(zhì)酶和幾

7、丁質(zhì)脫乙酰酶高產(chǎn)菌株。幾丁質(zhì)酶高產(chǎn)菌株的初篩選是利用以膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從中挑出100株產(chǎn)生較大透明圈的菌株，根據(jù)D值（透明圈與菌落直徑的比值）大小篩選出20株產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株。復(fù)篩選采用液體搖瓶發(fā)酵，DNS法測(cè)定酶活力的方法篩選出產(chǎn)酶能力最高的3株細(xì)菌，編號(hào)分別為Z4、F9和D5-23。其中菌株 Z4的酶活最大，達(dá)到了2.3 U/mL。菌體形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析表明菌株Z4屬于微桿菌屬(Micro

8、bacterium)。通過優(yōu)化培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件，其產(chǎn)酶能力得到極大的提高。首先以發(fā)酵液中的酶活為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定其產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳碳源和氮源分別為葡萄糖和酵母膏。在此基礎(chǔ)上采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定初始培養(yǎng)基中影響酶產(chǎn)量的主要因素分別是葡萄糖、酵母膏和培養(yǎng)基pH，經(jīng)過爬坡實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基組成進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，最終確定培養(yǎng)基主要因素的最佳組合為葡萄糖為0.314g/100mL，酵母膏

9、為0.308g/100mL，培養(yǎng)基 pH為7.41。在該培養(yǎng)基條件下，酶產(chǎn)量提高了78%。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響發(fā)酵的幾個(gè)因素，溫度(℃)、接種量(%)、裝液量（mL）和初始pH進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)確定Z4產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響最大，其次是pH、接種量和裝液量。四個(gè)因素的最佳組合為培養(yǎng)溫度28℃，起始pH7，裝液量60mL,接種量6%。在該條件下，酶產(chǎn)量提高了79.6%。
　　在培養(yǎng)基優(yōu)化過程中，還

10、發(fā)現(xiàn)Z4菌株幾丁質(zhì)酶合成存在多態(tài)現(xiàn)象，因此有必要對(duì)其幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行深入研究。此外將幾丁質(zhì)酶基因克隆到高效表達(dá)載體中使其進(jìn)行異源表達(dá)，這樣可以去除供體菌自身對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的代謝控制，也可以提高酶產(chǎn)量。為此根據(jù)GENE BANK中唯一的一個(gè)微桿菌屬幾丁質(zhì)酶基因序列和幾丁質(zhì)酶催化域氨基酸保守序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)其保守區(qū)域進(jìn)行 PCR擴(kuò)增和測(cè)序，獲得催化域192bp的一段DNA序列。對(duì)該序列的生物信息學(xué)分析表明該基因?yàn)閹锥≠|(zhì)酶基因，屬于糖

11、苷水解酶18家族。該序列的獲得為進(jìn)一步克隆其整個(gè)基因創(chuàng)造了條件，為進(jìn)一步基因的異源表達(dá)和分子改造奠定了基礎(chǔ)。
　　CDA高產(chǎn)菌株的篩選首先是通過變色圈法篩選出產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株，再通過比較發(fā)酵液中的酶活，篩選出產(chǎn)酶能力最強(qiáng)的菌株，編號(hào)為F2-7-3。根據(jù)菌體的形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析，確定該菌株屬于放線菌門（Actinobacteria）的紅球菌屬（Rhodococcus）。酶學(xué)性質(zhì)的研究表明該酶催化反應(yīng)的最適pH為7.

12、0、最適溫度為50℃。為提高幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的產(chǎn)量，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，首先通過單因素實(shí)驗(yàn)確定產(chǎn)酶培養(yǎng)基最佳碳源和氮源分別為蔗糖和酵母膏，通過正交試驗(yàn)確定初始培養(yǎng)基中對(duì)產(chǎn)酶影響最大的無(wú)機(jī)鹽是KH2PO4。據(jù)此，以發(fā)酵液酶活為響應(yīng)值，采用Box—Behnken設(shè)計(jì)構(gòu)建了培養(yǎng)基影響產(chǎn)酶的三個(gè)主要因素，蔗糖、酵母膏和KH2PO4的響應(yīng)曲面模型。該模型預(yù)測(cè)三個(gè)因素的最佳組合為：蔗糖7g/L；酵母膏9.15g/L；KH2PO4