大腸桿菌及金黃色葡萄球菌AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控研究.pdf

1、大多數(shù)情況下，環(huán)境中的細(xì)菌都不是以單個(gè)、液體浮游的形式存在，而是生長(zhǎng)在一個(gè)復(fù)雜的群體中，這個(gè)群體往往包含一種或多種細(xì)菌。同時(shí)由于環(huán)境的變化差異較大，細(xì)菌必須具備通過感知外界環(huán)境變化調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)從而更加適應(yīng)所處的環(huán)境的能力。尤其是對(duì)于致病菌而言，這一能力更加至關(guān)重要。因此，細(xì)菌在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了通過分泌自誘導(dǎo)物信號(hào)分子(autoinducer，AI)完成細(xì)胞與細(xì)胞間交流的重要機(jī)制，通常被稱為群體感應(yīng)(quorumsensing)

2、。群體感應(yīng)過程中，細(xì)菌合成并向胞外分泌信號(hào)分子。胞外聚集的信號(hào)小分子的濃度和細(xì)胞的數(shù)量成正相關(guān)，當(dāng)信號(hào)分子的濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，它們可以通過進(jìn)入胞內(nèi)或者與膜上的受體蛋白結(jié)合，產(chǎn)生一系列的調(diào)控作用，進(jìn)而使整個(gè)菌群產(chǎn)生協(xié)調(diào)一致的基因表達(dá)變化，并采取一些對(duì)整個(gè)菌群有利的行為方式，從而使細(xì)菌完成群體感應(yīng)的基因調(diào)控行為。 在目前已發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌信號(hào)感應(yīng)系統(tǒng)中，以酰基高絲氨酸內(nèi)酯AHL(autoinducer—1，AI—1)為信號(hào)分子的系統(tǒng)研究

3、最為成熟，許多革蘭氏陰性細(xì)菌，特別是變形桿菌類都以AHL作為種內(nèi)群體感應(yīng)的信號(hào)分子；革蘭氏陽性細(xì)菌通常利用寡肽(oligopeptide)作為種內(nèi)群體感應(yīng)的信號(hào)分了；同時(shí)還有一種特殊的信號(hào)感應(yīng)系統(tǒng)，既存在于革蘭氏陰性菌，同時(shí)也存在于革蘭氏陽性菌中，其信號(hào)分子被稱為(autoinducer—2，AI—2)。與前兩種自誘導(dǎo)物不同，革蘭氏陰性菌的AHL與革蘭氏陽性菌的寡肽特異性較高，主要負(fù)責(zé)種內(nèi)細(xì)菌之間的通訊，而AI—2及其合成酶LuxS保守

4、且廣泛存在于細(xì)菌中，人們推測(cè)AI—2可能在細(xì)菌種間的通訊中起重要作用。此外，LuxS被證明在細(xì)菌中具備雙重功能(代謝與信號(hào))，它既是甲基循環(huán)中—個(gè)重要的代謝酶，同時(shí)又在這一代謝過程中合成了副產(chǎn)物AI—2作為信號(hào)分子。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LuxS/AI—2系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)哈氏弧菌(Vibrioharveyi)發(fā)光、大腸桿菌(Escherichiacoli)的生物膜(biofilm)形成、霍亂弧菌(Vibriocholera)的毒性以及綠膿桿菌(

5、Pseudomonasaeruginosa)的致病性等等。然而，在革蘭氏陽性菌中，盡管時(shí)有少量的表型層面的研究證據(jù)被報(bào)道，LuxS/AI—2系統(tǒng)是否具備信號(hào)調(diào)控的功能口前仍頗具爭(zhēng)議，尤其在可以廣泛引起人類疾病的重要致病菌如金黃色葡萄球菌中，這方面的研究工作還很不夠。 據(jù)目前所知，AI—2的合成通路非常保守，但AI—2的信號(hào)感應(yīng)與傳遞機(jī)制在不同細(xì)菌種間是有差異的。目前，僅在少數(shù)幾種細(xì)菌中，有關(guān)于AI—2的信號(hào)感應(yīng)、傳遞及調(diào)控機(jī)制的

6、研究報(bào)道，即哈氏弧菌、霍亂弧菌、沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium)和大腸桿菌。在沙門氏菌和大腸桿菌中，早期被排出胞外的AI—2需要在對(duì)數(shù)后期被運(yùn)回胞內(nèi)來行使調(diào)控功能。存細(xì)胞生長(zhǎng)的前期，AI—2不斷在胞外聚集，而一旦絀胞生長(zhǎng)進(jìn)入了穩(wěn)定期，胞外AI—2的量則急劇下降。究其原因，AI—2是被Lst轉(zhuǎn)運(yùn)體(Lsrtransporter)運(yùn)入了胞內(nèi)?；蚪M上，lsr操縱子上游有一個(gè)反向轉(zhuǎn)錄的基因lsrR，編碼蛋白LsrR。早期

7、的研究證明，LsrR可以抑制lsr操縱子和它自身的轉(zhuǎn)錄。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)LsrR含有一個(gè)Helix-Turn—helix(HTH)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，故推斷它是通過直接與lsr和它自身基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合產(chǎn)生抑制作用，不過之前還沒有確切的證據(jù)。此外，據(jù)Xavier等人報(bào)道，LsrR還具有一個(gè)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可與AI—2結(jié)合，即LsrR是群體感應(yīng)信號(hào)分子AI—2在胞內(nèi)的受體，故而推測(cè)其可作為AI—2在胞內(nèi)的效應(yīng)單元產(chǎn)生對(duì)下游靶基因的調(diào)

8、控行為，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)也證明LsrR缺陷的菌株中有近百個(gè)基因水平有明顯變化，提示LsrR存細(xì)菌中可能做為一個(gè)重要的宏觀轉(zhuǎn)錄因子(globalregulator)在群體感應(yīng)行為中發(fā)揮主要作用。 本課題通過DNA凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，首次證明LsrR抑制基因表達(dá)是通過直接結(jié)合于他們的啟動(dòng)子區(qū)域的方式，給出了LsrR可以作為轉(zhuǎn)錄因子行使功能的直接體外證據(jù)；通過DNA足跡法(DNAfootprinting)實(shí)驗(yàn)，首次找到LsrR蛋白的特異性

9、結(jié)合序列，為將來LsrR蛋白新的下游調(diào)摔靶點(diǎn)的尋找提供了最直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)；通過生物信息學(xué)比對(duì)以及β—半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步對(duì)LsrR蛋白的特異性結(jié)合序列深入研究，發(fā)現(xiàn)在lsrR和1srA的啟動(dòng)子的結(jié)合序列內(nèi)，各有兩個(gè)富含AT的區(qū)域?qū)srR的結(jié)合至關(guān)重要。最后，我們通過體外磷酸化實(shí)驗(yàn)與凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，證明只有磷酸化的AI—2才可以解除LsrR對(duì)DNA的結(jié)合作用，這是對(duì)早前AI—2必須磷酸化才能行使功能的推論給出的體外的直接證據(jù)。

10、 此外，在金黃色葡萄球菌中，也展開實(shí)驗(yàn)對(duì)AI—2／Luxs系統(tǒng)是否具有信號(hào)調(diào)控功能進(jìn)行了研究。我們通過基因敲除以及生物芯片實(shí)驗(yàn)，尋找那些受LuxS以及AI—2調(diào)控的基因，并且初步證明了在金葡菌中，AI—2極有可能也作為一種自誘導(dǎo)物信號(hào)分子，參與一系列生理活動(dòng)的調(diào)控行為，如莢膜多糖的合成、生物膜形成以及藥物敏感性等等。金黃色葡萄球菌NCTC8325的luxS敲除株與野生型相比，莢膜多糖合成加強(qiáng)，生物膜形成增強(qiáng)，對(duì)抑制細(xì)胞壁合成類的抗生素