金黃色葡萄球菌毒素--抗毒素系統(tǒng)SavRS毒力調(diào)控的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌作為人類主要病原細(xì)菌之一，具有較強(qiáng)的流行性、致病性和適應(yīng)性。它能感染人體不同部位而導(dǎo)致多種感染性疾病，從常見的毛囊炎、潰瘍等組織感染性疾病，到中毒性休克綜合征、肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血病、骨髓炎等致命性疾病。它的強(qiáng)致病性主要是胞內(nèi)各種毒力因子及各種調(diào)控系統(tǒng)協(xié)同作用的結(jié)果。同時(shí)，在與環(huán)境或宿主的長期相互作用過程中，金黃色葡萄球菌進(jìn)化出了非常靈敏完善的應(yīng)答機(jī)制，具有極強(qiáng)的適應(yīng)性。胞內(nèi)二元信號(hào)系統(tǒng)、群體感應(yīng)系統(tǒng)、sigma因子家族等

2、一系列復(fù)雜而嚴(yán)密調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使細(xì)菌具備存活、引發(fā)感染、免疫逃逸等多方面能力。
　　毒素-抗毒素系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌和古菌中，它們通常由含有一個(gè)影響細(xì)菌生長的毒素和一個(gè)能抵消毒素毒性的抗毒素組成的雙順反子基因元件構(gòu)成。毒素-抗毒素系統(tǒng)不僅在維持質(zhì)粒穩(wěn)定、壓力條件下控制細(xì)胞生長、導(dǎo)致細(xì)胞程序化死亡、持留性細(xì)胞形成等細(xì)菌應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮功能，也能通過調(diào)控基因表達(dá)來影響細(xì)菌的生理行為，其毒素-抗毒素系統(tǒng)的調(diào)控功能主要由少數(shù)具有特異性識(shí)別序列的帶有

3、RNase活性的毒素蛋白完成。與其他細(xì)菌相似，金黃色葡萄球菌中也存在大量的毒素-抗毒素系統(tǒng)，但目前只有少數(shù)被鑒定，且生理功能研究極為缺乏。本研究闡述了一種由抗毒素介導(dǎo)的新型調(diào)控方式，抗毒素蛋白不僅能結(jié)合自身啟動(dòng)子進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，同時(shí)也能結(jié)合到其他靶基因的啟動(dòng)子對(duì)毒力基因進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響金黃色葡萄球菌的致病性。
　　我們通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌NCTC8325中的幾對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng)并進(jìn)行深入研究，其中由SAOUHS

4、C_02756-02757編碼的SavRS的功能最為獨(dú)特。SavRS被鑒定為金黃色葡萄球菌中Ⅱ型TA系統(tǒng)，毒素SavS具有強(qiáng)細(xì)胞毒性能使細(xì)菌致死，抗毒素SavR與之形成穩(wěn)定復(fù)合物抵消SavS的毒性使細(xì)菌在非壓力條件下正常生長。凝膠阻滯分析實(shí)驗(yàn)和等溫滴定微量熱試驗(yàn)證明，SavR能做為抑制子結(jié)合到自身啟動(dòng)子調(diào)節(jié)savRS的轉(zhuǎn)錄，SavS能與之形成復(fù)合物SavRS增強(qiáng)與啟動(dòng)子的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄抑制。DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)證明，SavRS與啟動(dòng)子的結(jié)合

5、序列中包含了一個(gè)序列為5'-TACGCTA****TAGCGTA-3'的長回文序列和一個(gè)序列為5'-ACT**AGT-3'的短回文序列。進(jìn)一步對(duì)回文序列引入點(diǎn)突變后發(fā)現(xiàn)，回文序列對(duì)蛋白與DNA的結(jié)合和基因轉(zhuǎn)錄抑制至關(guān)重要。更有趣的是，敲除savRS后，突變菌株的溶血活性明顯增強(qiáng)。我們通過實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)了突變菌株中毒力基因hla和efb的表達(dá)水平明顯上升，其中hla編碼能裂解紅細(xì)胞的α溶血素，efb編碼阻止血小板凝集的胞外纖連蛋白。進(jìn)

6、一步的凝膠阻滯分析實(shí)驗(yàn)證明，SavR和SavRS均能結(jié)合到savRS的啟動(dòng)子區(qū)域，從而抑制毒力基因的表達(dá)。最后，我們通過小鼠膿腫模型對(duì)savRS突變菌株的致病性進(jìn)行了評(píng)估，savRS突變菌株能引起更嚴(yán)重的膿腫和感染，且在小鼠體內(nèi)有更強(qiáng)的生存能力。這種新型的由抗毒素介導(dǎo)的調(diào)控方式不僅讓我們對(duì)毒素-抗毒素的生理功能有了新的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也豐富了金黃色葡萄球菌中毒力因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)savS突變菌株明顯降低了細(xì)菌在氨芐青霉素中