揚(yáng)子鱷基因組BAC文庫(kù)及MHCⅡ類(lèi)基因和QR基因物理圖譜的構(gòu)建.pdf

1、揚(yáng)子鱷(Alligator sinensis)是我國(guó)特有的珍稀瀕危野生動(dòng)物，長(zhǎng)期以來(lái)，由于環(huán)境惡化、棲息地喪失以及人類(lèi)活動(dòng)的影響，其野外種群的數(shù)量急劇下降，目前只有在安徽、浙江兩省交界區(qū)域有所分布，種群數(shù)量已不足120條。為保護(hù)這一珍稀瀕危物種的，我國(guó)政府已經(jīng)采取了一系列措施。1972年將揚(yáng)子鱷列為Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，1978年、1982年和1979年相繼建立了安徽宣州揚(yáng)子鱷繁殖研究中心、揚(yáng)子鱷自然保護(hù)區(qū)、浙江長(zhǎng)興揚(yáng)子鱷自然繁育研究中

2、心等機(jī)構(gòu)。
　　 為了保護(hù)揚(yáng)子鱷的基因資源，本文以長(zhǎng)興揚(yáng)子鱷自然繁育研究中心提供的血液樣品為材料，以細(xì)菌人工染色體(BAC)為載體，成功建立了高質(zhì)量的揚(yáng)子鱷基因組BAC文庫(kù)。以該文庫(kù)為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建了揚(yáng)子鱷主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類(lèi)基因和嗅覺(jué)受體(OR)基因的克隆重疊群，既驗(yàn)證了該文庫(kù)的有效性，又對(duì)文庫(kù)進(jìn)行了基礎(chǔ)研究的應(yīng)用。其主要研究結(jié)果如下：
　　 1.以新鮮外周血為材料，利用pCC1BAC載體，成功構(gòu)建了揚(yáng)子

3、鱷的基因組細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫(kù)。文庫(kù)包含的216238個(gè)BAC克隆，保存于2254塊96孔培養(yǎng)板上。經(jīng)對(duì)隨機(jī)挑取的150個(gè)BAC克隆進(jìn)行電泳檢測(cè)，計(jì)算出文庫(kù)的平均插入片段為90kb，覆蓋揚(yáng)子鱷基因組約6.8倍(除去5.33％的空載體)。同時(shí)，從文庫(kù)中獲得任一單拷貝或多拷貝揚(yáng)子鱷基因的概率為99.93％；
　　 2.運(yùn)用4D-PCR文庫(kù)篩選技術(shù)，建立了揚(yáng)子鱷基因組BAC文庫(kù)的高效PCR篩選文庫(kù)。該文庫(kù)包括46個(gè)超級(jí)庫(kù)和15

4、64(46×34)個(gè)1D、2D、3D、4D超級(jí)亞庫(kù)。任一引物或探針只需80個(gè)PCR反應(yīng)，即可從BAC文庫(kù)中篩選到所需的陽(yáng)性BAC克??；
　　 3.用7對(duì)揚(yáng)子鱷特異性PCR引物進(jìn)行文庫(kù)篩選，平均每對(duì)能夠在文庫(kù)中成功擴(kuò)增到6.1個(gè)陽(yáng)性克隆，表明了所建文庫(kù)具有較高的覆蓋率，并與文庫(kù)覆蓋率計(jì)算結(jié)果(6.8)基本達(dá)成一致。
　　 4.基于MHCⅡ類(lèi)以及OR基因的同源序列，成功設(shè)計(jì)了三對(duì)通用引物，并從揚(yáng)子鱷基因組BAC文庫(kù)中篩選到陽(yáng)