野生稻基因組富集文庫的構(gòu)建及抗性基因篩選.pdf

1、野生稻中含有豐富的有利基因，是拓展栽培稻遺傳基礎(chǔ)的重要基因資源，但傳統(tǒng)雜交轉(zhuǎn)育種存在由于生殖隔離引起的諸多局限性，直接從野生稻中克隆有利基因也由于野生稻基因組背景知識(shí)的匿乏等因素而存在困難。本研究集成了候選抗性基因克隆技術(shù)和磁珠富集文庫技術(shù)以及可轉(zhuǎn)化基因組文庫技術(shù)，提出了基于候選抗性基因富集文庫克隆野生稻新抗性基因的策略。它包括構(gòu)建野生稻可轉(zhuǎn)化基因組文庫，利用RecA重組蛋白介導(dǎo)生物素標(biāo)記的探針對(duì)文庫進(jìn)行磁珠富集，構(gòu)建候選抗性基因富集文

2、庫。探針為根據(jù)抗性基因NBS-LRR類保守序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并特異性引物和特異性引物對(duì)野生稻的擴(kuò)增產(chǎn)物。然后，對(duì)富集文庫的克隆進(jìn)行鑒定分析，包括點(diǎn)雜交和克隆末端測(cè)序分析。最后，對(duì)富集文庫的克隆進(jìn)行全序列測(cè)定分析和功能驗(yàn)證。本研究構(gòu)建了東鄉(xiāng)和小粒野生稻可轉(zhuǎn)化基因組文庫，庫容量分別達(dá)到97.01％和98.42％，進(jìn)而構(gòu)建了野生稻候選抗性基因富集文庫，單克隆總數(shù)10368個(gè)，對(duì)富集文庫的菌落原位雜交篩選獲得22個(gè)陽性克隆。陽性克隆末端測(cè)序結(jié)果表明，