產(chǎn)紫杉醇菌株原生質(zhì)體誘變育種及其生物合成調(diào)控的研究.pdf

1、腫瘤和癌癥是目前嚴(yán)重威脅人類生命的頑癥之一.對(duì)于人類來(lái)說(shuō),這是僅次于心腦血管疾病的第二大死因.長(zhǎng)期以來(lái),世界各國(guó)的許多學(xué)者對(duì)于各種癌癥的防治進(jìn)行了種種嘗試與探索,但結(jié)果都不甚令人滿意.目前,紫杉醇己被國(guó)內(nèi)外一致公認(rèn)為是一類對(duì)多種癌癥具有顯效乃至特效的抗癌新藥.因此,采取各種途徑生產(chǎn)紫杉醇已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外紫杉醇研究和規(guī)模開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn).與其它方法相比,微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的優(yōu)勢(shì)是顯而易見(jiàn)的.本試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,對(duì)影響紫杉醇產(chǎn)生菌UV

2、<,40-19>.合成紫杉醇的培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液初始pH、搖床轉(zhuǎn)數(shù)進(jìn)行了探討,確定了最佳培養(yǎng)條件;通過(guò)單因子和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究了前體物、誘導(dǎo)子和抑制劑及其協(xié)同對(duì)紫杉醇產(chǎn)生菌合成紫杉醇的調(diào)控作用.同時(shí),對(duì)紫杉醇菌株UV<,40-19>的原生質(zhì)體制備、再生及紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變育種進(jìn)行了研究篩選潮霉素抗性突變株.另外,通過(guò)同工酶技術(shù)、RAPD、AFLP和ITS序列分析對(duì)出發(fā)菌株NCEU-1與兩高產(chǎn)株UV<,40-19>和UL<,50-6>

3、間的遺傳差異進(jìn)行了研究.此外,利用Southern blotting技術(shù)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中紫杉二烯合成酶是否也存在于通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的生物合成途徑中進(jìn)行了初探.目前,在利用紫杉醇產(chǎn)生菌合成紫杉醇的研究領(lǐng)域內(nèi),尚未見(jiàn)有關(guān)本試驗(yàn)研究方面的報(bào)道.因此,本試驗(yàn)在這幾方面研究取得的突破性進(jìn)展,為通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇的生物合成調(diào)控和構(gòu)建高產(chǎn)基因工程菌株提供了強(qiáng)有力的理論指導(dǎo);為早日實(shí)現(xiàn)利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇的工業(yè)化生產(chǎn)

4、、創(chuàng)造巨大經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益展示了美好的前景. 本試驗(yàn)的主要研究結(jié)果如下: 1、紫杉醇產(chǎn)生菌UV<,40-19>生物合成紫杉醇的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為:S-7發(fā)酵液初始pH5.5,搖床溫度25℃,搖床轉(zhuǎn)速150r/min; 2、向S-7發(fā)酵培養(yǎng)基添加適當(dāng)濃度的前體物、代謝旁路抑制劑和誘導(dǎo)子對(duì)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的合成代謝進(jìn)行綜合調(diào)控可以大大提高紫杉醇的產(chǎn)量: 3、采用試驗(yàn)得出的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件,以篩選出的優(yōu)化培養(yǎng)基

5、作為發(fā)酵培養(yǎng)基,菌株UV<,40-19>發(fā)酵液中紫杉醇含量為493.74μg/L,是改良S-7發(fā)酵培養(yǎng)基的1.25倍; 4、Nodulisporium sylviforme 紫杉醇產(chǎn)生菌UV<,40-19>原生質(zhì)體制備及再生的最佳條件為:每 250mg 濕菌絲體加酶液1 mL(0.7mol/LNaCl配制由3﹪溶壁酶+3﹪?yán)w維素酶+4﹪蝸牛酶+1﹪的溶菌酶組成的復(fù)合酶系,pH5.5～6.0)→0℃振蕩酶解5h→酶解液用三層無(wú)菌鏡

6、頭紙過(guò)濾→3000r/min離心 10min,收集原生質(zhì)體;將獲得的原生質(zhì)體在含NaCl∶KCl∶葡萄糖(5∶3∶2,v/v/v,終濃度均為0.7mol/L)的PDA再生培養(yǎng)基上,采用雙層平板培養(yǎng)法再生制備到的原生質(zhì)體; 5、Nodulisporium sylviforme 紫杉醇產(chǎn)生菌UV<,40-19>原生質(zhì)體誘變的適宜條件為:將原生質(zhì)體懸液經(jīng)過(guò)0.8mg/mL NTG、處理15min 后,在電磁攪拌下,用紫外燈(30w,距

7、離3 0cm)照射處理40s; 6、在潮霉素含量為90μg/mL的抗性平皿中篩選出了一株高產(chǎn)紫杉醇的原生質(zhì)體誘變菌株-UN<,05-3>,其產(chǎn)量從出發(fā)菌株紫杉醇的產(chǎn)量 (376.38±8.41)μg/L提高至(478.12±11.36)μg/L; 7、探索出了一種新的、快速而高效的樹(shù)狀多節(jié)孢紫杉醇產(chǎn)生菌基因組DNA的提取方法; 8、通過(guò)同工酶技術(shù)、RAPD、AFLP和ITS序列分析表明,出發(fā)菌株與誘變菌株之間以及

8、兩誘變菌株之間都存在明顯差異,為進(jìn)一步研究與紫杉醇生物合成相關(guān)基因及誘變株產(chǎn)量提高的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ); 9、從東北紅豆杉 (Taxus cuspidata) 樹(shù)葉中獲得了紫杉二烯合成酶基因片段克隆,用GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中的Blast程序?qū)Υ藗€(gè)序列與GenBank中收錄的序列進(jìn)行了同源性比較,同源性達(dá)到98﹪; 10、首次證實(shí)了紫杉二烯合成酶基因也存在于紫杉醇產(chǎn)生菌--