重組鉤端螺旋體三聯(lián)體抗原蛋白原核表達(dá)條件的優(yōu)化和高密度發(fā)酵.pdf

1、背景和目的： 鉤端螺旋體屬于螺旋體目鉤端螺旋體科鉤端螺旋體屬(Leptospira)的原核細(xì)胞型微生物，鉤端螺旋體(簡稱鉤體)，自然宿主眾多，其中對人類危害最大的是鼠類、蛙類和家畜。鉤體可在水中生存數(shù)周，人類通過接觸隨自然宿主尿液排出鉤體的污染水源而引起鉤體病。鉤體病是全球流行最廣、危害較大的人獸共患病。目前，接種疫苗是預(yù)防和控制鉤體病最有效的措施。然而，鉤體血清群、型眾多，各個(gè)血清群、型抗體之間交叉保護(hù)作用較弱或無，目前普遍使

2、用的鉤體疫苗為根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍械臄?shù)種優(yōu)勢鉤體血清群構(gòu)成的多價(jià)鉤體全細(xì)胞死疫苗，效果較差而且毒副作用大。因此，若能確定鉤體屬特異性抗原，對于鉤體病預(yù)防和控制具有極為重要的現(xiàn)實(shí)意義。 現(xiàn)在研究證實(shí)OMPl1／2、lipL21和lipL32／1基因型包含了我國人群中流行最廣的問號鉤體血清群、型。各基因型重組表達(dá)產(chǎn)物免疫家兔可產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，任一兔抗血清均能交叉凝集所有受試菌株并能阻斷問號鉤體黏附宿主細(xì)胞。因此，我們認(rèn)為，OMPl1／2、

3、lipL21和lipL,32／1基因產(chǎn)物是具有良好抗原性和免疫反應(yīng)性的屬特異性表面蛋白抗原。本實(shí)驗(yàn)室為了提高抗原的免疫原性、減少工程發(fā)酵次數(shù)和降低生產(chǎn)成本，進(jìn)一步構(gòu)建了rOMPL1／2-rLipL21和rLipL32／1融合基因的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。 大腸桿菌在重組蛋白生產(chǎn)的過程中占主導(dǎo)地位。其具有遺傳性比較清楚、易培養(yǎng)、發(fā)酵周期短的優(yōu)點(diǎn)、在高密度時(shí)氧氣供應(yīng)受限時(shí)是仍能生長的特性，成為重組基因表達(dá)良好宿主，大腸桿菌宿主已經(jīng)被廣泛的

4、用于表達(dá)外源蛋白。利用大腸桿菌高密度發(fā)酵是提高重組外源基因高表達(dá)的一個(gè)有效途徑，但是重組大腸桿菌的表達(dá)受很多因素的影響，為提高目的抗原的表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖莾?yōu)化重組大腸桿菌生長條件和表達(dá)條件，使重組抗原蛋白實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，為工業(yè)大規(guī)模發(fā)酵提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和參考，同時(shí)回收和純化目的產(chǎn)物，進(jìn)行免疫學(xué)鑒定。 實(shí)驗(yàn)方法： 活化保存的重組菌并鑒定，利用單因子實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化不同因素對重組大腸桿菌生長和表達(dá)的影響，從而得最優(yōu)的表

5、達(dá)條件，并對工程菌質(zhì)粒的穩(wěn)定性，發(fā)酵過程的影響因素進(jìn)行了研究，在前期實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行中試，利用溶氧反饋的補(bǔ)料流加技術(shù)，實(shí)現(xiàn)重組大腸桿菌高密度表達(dá)，親和層析純化回收目的抗原，利用SDS-PAGE和Western鑒定產(chǎn)物。 結(jié)果： 在搖瓶實(shí)驗(yàn)中，在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上我們采用基于中心復(fù)合設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析方法獲得了目的重組蛋白最優(yōu)的表達(dá)條件是：pH7.9、0.20mol／L IPTG、誘導(dǎo)前時(shí)間2.5 h、誘導(dǎo)后時(shí)間5.

6、83 h、誘導(dǎo)后溫度31℃可獲得最大表達(dá)量，在該條件下目的蛋白的產(chǎn)量比未優(yōu)化之前提高了2.7倍，在此基礎(chǔ)上我們利用溶氧反饋補(bǔ)料流加技術(shù)，在15h、30L發(fā)酵罐中獲得了OD600值為105的菌體濃度，目的蛋白產(chǎn)量11.08g，極大地提高了產(chǎn)量，純化回收目的蛋白經(jīng)SDS和Western鑒定為具有良好免疫原性的目的蛋白。 結(jié)論： 本研究通過優(yōu)化生長條件，我們獲得了最佳的蛋白表達(dá)參數(shù)，成功的提高了重組大腸桿菌目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。