問號鉤端螺旋體ompA基因分析及其重組表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)鑒定.pdf

1、目的： 了解我國15群15株問號鉤端螺旋體(簡稱問號鉤體)參考標(biāo)準(zhǔn)株和雙曲鉤體國際參考標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)atocⅠ株攜帶ompA基因情況，構(gòu)建該基因的原核表達(dá)系統(tǒng)E. coli BL21DE3pET42a-ompA，重組表達(dá)OmpA(rOmpA)并鑒定rOmpA的免疫原性和免疫保護(hù)性。 方法： 1、采用常規(guī)酚-氯仿法提取16株鉤端螺旋體的基因組DNA，PCR擴(kuò)增全長ompA基因，T-A克隆后測序。 2、構(gòu)建問號鉤端

2、螺旋體黃疸出血群賴型56601株ompA基因的原核表達(dá)系統(tǒng)E. coli BL21DE3pET42a-ompA，并采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢測rOmpA表達(dá)情況及其產(chǎn)量。 3、rOmpA免疫家兔以獲得抗血清，采用免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)檢測抗血清的效價(jià)。采用Western Blot檢測rOmpA與其抗血清和問號鉤體56601株全菌抗血清的免疫反應(yīng)性，顯微鏡凝集試驗(yàn)(MAT)檢測rOmpA抗血清對15株問號鉤體的

3、交叉凝集情況。 4、分別用問號鉤體黏附小鼠單核-巨噬樣細(xì)胞株J774A.1細(xì)胞模型和豚鼠感染模型了解rOmpA兔抗血清黏附阻斷及rOmpA的免疫保護(hù)作用。 結(jié)果： 1、15株問號鉤體參考標(biāo)準(zhǔn)株均含有序列保守的ompA基因，與已報(bào)道的問號鉤體黃疸出血群賴型賴株ompA基因比較，其核苷酸和氨基酸序列相似性分別為99.4％～99.9％和98.4％～99.7％，而雙曲鉤體PatocⅠ株則不含ompA基因。 2、所

4、構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)其rOmpA表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的20％。 3、rOmpA能誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生抗體，其抗血清免疫擴(kuò)散效價(jià)為1：4。兔抗血清及問號鉤體56601株全菌抗血清均能與rOmpA產(chǎn)生陽性Western雜交信號。rOmpA抗血清對15株問號鉤體的MAT效價(jià)為1：20～1：320。 4、粘附阻斷試驗(yàn)顯示1：10～1：160稀釋的rOmpA抗血清均能阻斷問號鉤體黏附J774A.1細(xì)胞，而豚鼠保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示100μg和20