雙齒圍沙蠶消化道菌群的分析和生物活性物質(zhì)的研究.pdf

1、海洋微生物是以海洋生物、水體為正常棲居環(huán)境的一類微生物，由于所處的特殊生活環(huán)境，使其具有產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的巨大潛力，已成為生物活性物質(zhì)開發(fā)的重要來源。雙齒圍沙蠶是一種主要生活在海邊潮間帶的海洋生物，近年來研究人員已從其體內(nèi)分離出多種生物活性物質(zhì)。鑒于其可以生活在污染嚴(yán)重的環(huán)境，并能幫助改善和治理環(huán)境污染，故推測(cè)其體內(nèi)可能具有多種生物活性物質(zhì)或特殊的微生態(tài)菌群，以幫助其拮抗外界污染環(huán)境的損害。本研究對(duì)雙齒圍沙蠶消化道菌群進(jìn)行了分析，篩選出

2、了部分生物活性菌株，并對(duì)獲得的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌蛋白酶的酶學(xué)特征和纖溶活性進(jìn)行了研究。 本課題從不同來源雙齒圍沙蠶的消化道中共分離出17株細(xì)菌，其中有6株至少對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌等指示菌中的1種有抑制作用，3株細(xì)菌至少對(duì)1種腫瘤細(xì)胞(HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞)有細(xì)胞毒活性。菌株Y1、Y7均同時(shí)具有不同程度程度的抑菌活性和細(xì)胞毒性，經(jīng)形態(tài)生理、16S rRNA基因序列鑒定，分別為E.aurant

3、iacum和S.marisflavi。奶粉平板法篩選發(fā)現(xiàn)5株細(xì)菌能產(chǎn)生蛋白酶，其中D2菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力。纖維蛋白平板法檢測(cè)顯示，菌株’Y5、D2株均具有體外纖溶解活性。沙蠶的消化道活性菌株總分離率高于海水等。 在對(duì)從雙齒圍沙蠶消化道內(nèi)分離出的具有體外纖維蛋白溶解活性的菌株Y5進(jìn)行鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，其形態(tài)為革蘭陰性直桿狀，無芽孢和鞭毛，大小為0.5μm～0.8μm×1.5μm～3.0μm；生長溫度范圍為4℃～40℃；具有嗜鹽性，N

4、aCI耐受范圍為1％～13％；氧化酶、過氧化氫酶、精氨酸雙水解試驗(yàn)陽性，不還原硝酸鹽：可利用葡糖糖、麥芽糖為唯一碳源；精氨酸脫羧實(shí)驗(yàn)陽性；細(xì)胞主要脂肪酸成分為C18:1ω7c，C16:1ω7c，C16：0，C10:03-OH。DNA(G+C)mol％為47.5％。其16S rRNA基因序列與9種已確定的海單胞菌同源性為93％～97％，且都位于系統(tǒng)發(fā)生樹的同一類群中，并與M.aquimarina和M vaga共同構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化枝。根據(jù)

5、菌株Y5的生理學(xué)、遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)生特征確定，菌株Y5屬于海單胞菌屬，但與已報(bào)道的該屬其他菌種的某些特征不完全一致，可能為該菌屬的一個(gè)未定種/新種，暫命名為沙蠶海單胞菌(M.aibuhitensis sp.nov.)，這也是首次從我國海域分離出該屬細(xì)菌菌株。此外，該菌株具有一定纖溶活性。 菌株D2同時(shí)具有強(qiáng)產(chǎn)蛋白酶能力和體外纖溶活性，經(jīng)鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，并對(duì)其產(chǎn)蛋白酶條件和蛋白酶學(xué)特征進(jìn)行了研究。Lowry法檢測(cè)顯示該菌株產(chǎn)

6、酶能力為1104U/mL，最佳產(chǎn)酶條件為pH8.0、25℃培養(yǎng)48h。酪蛋白酶圖譜法和凝膠成像分析證實(shí)其蛋白酶分子量約為42kDa，在培養(yǎng)上清液中純度大于92％。經(jīng)過飽和硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換層析、Superdex G一75凝膠過濾層析等步驟純化獲得的D2蛋白酶(嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌蛋白酶，SMP)，比活性達(dá)到1478.0U/mg。該酶活性的最適pH值為9.0，是一種堿性蛋白酶；最適溫度為60℃，在55℃以下及p

7、H6～9的環(huán)境中具有較好的穩(wěn)定性。SMP的等電點(diǎn)為9.17。Cu2+、Ca2+、Mg2+、K+等金屬離子對(duì)SMP活性有明顯促進(jìn)作用，EDTA和PMSF能強(qiáng)烈抑制酶活力，但對(duì)尿素、SDS、DTT等變性劑有較好的耐受性，因此可能是一種金屬離子依賴性的絲氨酸堿性蛋白酶。在氨基酸序列測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)其N末端被修飾，故未能得到該酶的N-末端序列。隨后改用ESI-MS/MS質(zhì)譜分析，獲得的其兩個(gè)內(nèi)部肽段序列經(jīng)過檢索未發(fā)現(xiàn)與其序列一致性高的蛋白，提示SMP

8、可能是一種新的蛋白酶。鑒于SMP良好的穩(wěn)定性和較寬的溫度、pH活性范圍，以及菌株D2的高產(chǎn)酶特性，該株有望成為新的蛋白酶生產(chǎn)資源。 本研究還對(duì)SMP的纖溶活性及機(jī)制進(jìn)行了研究和初步探討。體外實(shí)驗(yàn)(試管凝塊法和纖維蛋白平板法)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(大鼠動(dòng)靜脈旁路血栓模型)均證實(shí)SMP同時(shí)具有溶解纖維蛋白原和纖維蛋白的活性，且活性呈一定的量效關(guān)系，因此，具有抗凝和溶栓雙重作用。此外，SMP可不依賴于纖溶酶原的激活直接溶解纖維蛋白，能在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物