放射性食管炎患者消化道菌群結(jié)構(gòu)多樣性研究.pdf

1、研究背景:
　　放射性食管炎是當前胸部腫瘤放療過程中的常見并發(fā)癥。疾病的主要病理改變?yōu)槭彻莛つな芊派渚€照射后出現(xiàn)的局部充血、水腫，隨病情進展進一步表現(xiàn)為食管局部狹窄，瘢痕樣改變。與之相對應(yīng)，患者表現(xiàn)出進食不適，胸骨后燒灼感、胸部疼痛等臨床癥狀。當前放射性食管炎的診斷以臨床癥狀為診斷依據(jù)，缺乏特異性診斷指標、有效的評估手段。放射性食管炎的發(fā)病以及病情進展與放射劑量成正相關(guān)改變。放射性食管炎不僅直接影響患者生活質(zhì)量，提高食管氣管瘺等放

2、射相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率，亦可影響患者遠期治療效果。
　　隨著分子生物學的發(fā)展，運用高通量測序技術(shù)結(jié)合宏基因組學的技術(shù)路線分析人體微生物菌落結(jié)構(gòu)變化與疾病的發(fā)生相關(guān)性研究已廣泛展開，當前大部分研究以糞便為標本研究消化道微生物展開，關(guān)注消化道微生物與代謝性疾病及消化道疾病的相關(guān)性。食管作為消化道的重要組成部分，已有相關(guān)研究證明食管內(nèi)存在豐富的菌群分布。食管微生物群落構(gòu)成的改變與真菌性食管炎、反流性食管炎等疾病的發(fā)生、發(fā)展存在直接聯(lián)系。作

3、為胸部腫瘤放療過程中的常見并發(fā)癥，放射性食管炎放療過程中菌群結(jié)構(gòu)的改變尚不明確，通過高通量測序技術(shù)分析放射性食管炎患者菌群結(jié)構(gòu)及多樣性特征的研究也未見報道。
　　研究目的:
　　應(yīng)用高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息分析技術(shù)探究放射性食管炎患者消化道菌群多樣性特征;探究放療對消化道菌群結(jié)構(gòu)改變的影響并尋找與放射性食管炎疾病相關(guān)的特異菌種;為探索放射性食管炎新的預(yù)防與治療方式提供理論指導。
　　材料與方法:
　　本研究中采

4、用糞便菌群代表消化道菌群，分三個時間段采集標本:一為患者入院未行任何治療前;二為患者放療過程中出現(xiàn)放射性食管炎癥狀且未行對癥治療前;三為放療治療結(jié)束后。同時收集健康人群糞便作為對照。本研究收集32例放射性食管炎患者糞便樣本作為試驗組，同時收集41例健康人群糞便標本作為對照組。
　　主要實驗步驟方法如下:
　　1.基因片段獲取:采用物理破碎結(jié)合化學裂解的方法提取樣本中的細菌DNA，利用特異性內(nèi)切酶提取細菌的16S rDNA片段

5、。
　　2.擴增基因片段:利用軟件設(shè)計擴增引物，應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)針對16S rRNA序列的高變區(qū)進行擴增。
　　3.測序:利用454焦磷酸高通量測序平臺對16S rRNA序列的可變區(qū)擴增子進行高通量測序，獲取原始數(shù)據(jù)。
　　4.物種注釋:分析原始數(shù)據(jù)，鑒定細菌操作分類單元（OTUs，相當于種的水平），根據(jù)OTU相似性進行分類得到菌種分布，與細菌基因文庫比對明確各菌種對應(yīng)的細菌類型。
　　5.統(tǒng)計分析:

6、應(yīng)用生物信息學技術(shù)得到菌種分布的稀釋曲線、Chao1曲線、Shannon曲線等進行樣本內(nèi)復(fù)雜度分析（α多樣性），評估測序有效性及樣本內(nèi)的菌種分布。通過主坐標分析(PCoA)和UPGMA聚類分析進行放射性食管炎患者與健康人群菌群結(jié)構(gòu)的樣本間比較分析（β多樣性），尋找與疾病相關(guān)特異性菌種。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過對下機數(shù)據(jù)的預(yù)處理，各樣本數(shù)據(jù)均滿足后續(xù)分析要求，通過α多樣性分析證實各樣本測序深度足以覆蓋樣本內(nèi)菌群分布，各組樣本

7、豐度及均勻度均好。
　　2.高通量測序結(jié)果顯示放射性食管炎患者的菌群多樣性與健康人群存在明顯差異。放射治療前后患者消化道菌群存在明顯差異。
　　3.放射性食管炎患者消化道菌群的主要組成有厚壁菌門、擬桿菌、變形菌門、梭菌屬、放線菌、藍藻菌門、軟壁菌門。其菌種構(gòu)成與健康人相似，但其菌種豐度存在明顯差異。
　　4.不同原發(fā)疾病的放射性食管炎患者消化道菌群構(gòu)成未見明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1、放射性食管炎患者消化