乳酸菌群早期消化道定植的實(shí)驗(yàn)與臨床研究.pdf

1、目的：雙歧桿菌和乳桿菌等乳酸菌是消化道內(nèi)最重要的生理性益生菌群,本研究通過(guò)建立雙歧桿菌和乳桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR)檢測(cè)技術(shù),對(duì)腸外營(yíng)養(yǎng)幼兔腸道雙歧桿菌和乳桿菌的變化、不同分娩方式下健康新生兒腸道雙歧桿菌和乳桿菌的定植過(guò)程、先天性消化道畸形新生兒術(shù)后腸道雙歧桿菌和乳桿菌的定植過(guò)程進(jìn)行系列研究. 材料與方法: 1.熒光定量PCR技術(shù)建立:根據(jù)雙歧桿菌和乳桿菌16sDNA

2、序列合成屬特異性引物,抽提雙歧桿菌和乳桿菌凍干菌粉中細(xì)菌組DNA,應(yīng)用引物擴(kuò)增特異性目標(biāo)片斷,經(jīng)轉(zhuǎn)染、克隆制備外標(biāo)準(zhǔn)品,系列稀釋后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),分析特異性、敏感性、重復(fù)性,并對(duì)已知濃度樣品和未知濃度糞便樣品進(jìn)行驗(yàn)證性分析. 2.外源性雙歧桿菌對(duì)PN幼兔腸道雙歧桿菌和乳桿菌早期定植的影響:生后2周的新西蘭種白兔分為對(duì)照組、PN組和PN+雙歧桿菌組.對(duì)照組母乳喂養(yǎng),PN組每日經(jīng)頸靜脈插管連續(xù)24h輸入營(yíng)養(yǎng)

3、液(210kcal/kg/d)；PN斗雙歧組在輸入和PN組等熱量營(yíng)養(yǎng)液同時(shí),每日經(jīng)胃管給予雙歧桿菌活菌0.5×10<'8>.實(shí)驗(yàn)第10d,對(duì)幼兔糞便進(jìn)行雙歧桿菌和乳桿菌定量分析. 3.不同分娩方式下母乳喂養(yǎng)新生兒腸道雙歧桿菌和乳桿菌早期定植的研究:以2006年1月至2006年12月于我院出生的陰道分娩和剖腹產(chǎn)分娩的健康足月母乳喂養(yǎng)新生兒各20例為觀察對(duì)象,連續(xù)檢測(cè)其生后7天糞便內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量. 4.先天性消化道

4、畸形新生兒術(shù)后腸道雙歧桿菌和乳桿菌早期定植的研究:以2006年1月～2007年2月我院兒外科連續(xù)收治的12例先天性食道閉鎖和先天性小腸閉鎖新生兒作為研究對(duì)象,連續(xù)檢測(cè)其住院期間糞便內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量,并記錄相關(guān)臨床資料,分析影響其腸道定植的可能因素. 結(jié)果： 1.熒光定量PCR技術(shù)建立:應(yīng)用屬特異性引物作常規(guī)PCR,電泳顯示雙歧桿菌擴(kuò)增條帶為1428bp,乳桿菌擴(kuò)增條帶為600bp,陰性對(duì)照大腸桿菌未見(jiàn)擴(kuò)增條帶,說(shuō)

5、明所用引物能準(zhǔn)確鑒別雙歧桿菌和乳桿菌；梯度稀釋外標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增獲得6濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),回歸系數(shù)r>0.99,靈敏度達(dá)10<'2>,復(fù)孔擴(kuò)增顯示重復(fù)性良好,擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線(xiàn)顯示單峰,說(shuō)明產(chǎn)物單一.已知濃度樣品檢測(cè)結(jié)果精確,糞便樣品檢測(cè)結(jié)果均成陽(yáng)性. 2.外源性雙歧桿菌對(duì)PN幼兔腸道雙歧桿菌和乳桿菌早期定植的影響:PN組幼兔雙歧桿菌和乳桿菌含量(log拷貝數(shù)/0.05g濕糞)分別為4.62±0.24和4

6、.29±0.49,顯著低于對(duì)照組 (分別為5.84±0.92,5.14±1.07,P<0.01) 和雙歧組(6.41±0.39,5.46±0.61,P<0.01)；雙歧組兩菌含量略高于對(duì)照組,但差異無(wú)顯著性(P>0.05). 3.不同分娩方式下母乳喂養(yǎng)新生兒腸道雙歧桿菌和乳桿菌早期定植的研究:生后一周內(nèi)陰道分娩組雙歧桿菌數(shù)量(10g拷貝數(shù)/g濕糞)由5.1升至9.3,剖腹產(chǎn)組由低于4.6的檢測(cè)低限值升至8.7,兩組差異顯著(P<

7、0.05),剖腹產(chǎn)組有6例新生兒生后第2天雙歧桿菌檢測(cè)陰性；陰道分娩組乳桿菌數(shù)量由4.9升至7.2,剖腹產(chǎn)組由4.9升至6.9,兩組差異無(wú)顯著性(P>0.05). 4.先天性消化道畸形新生兒術(shù)后腸道雙歧桿菌和乳桿菌早期定植的研究:雙歧桿菌定植時(shí)間為生后13天,乳桿菌為12天；雙歧桿菌和乳桿菌定植時(shí)間隨抗生素應(yīng)用時(shí)間不同而變化.雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量在患兒達(dá)到全腸內(nèi)喂養(yǎng)后出現(xiàn)一個(gè)較快的增長(zhǎng)期,乳桿菌增殖速度較雙歧桿菌快,出院時(shí)患兒腸

8、道內(nèi)雙歧桿菌平均水平(10g拷貝數(shù)儋濕糞)為6.05,乳桿菌平均水平為7.01. 小結(jié): 1.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)能對(duì)糞便樣品內(nèi)的雙歧桿菌和乳桿菌做精確定量分析. 2.PN導(dǎo)致幼兔腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量減少；外源性雙歧桿菌干預(yù)后可提高PN幼兔腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量. 3.剖腹產(chǎn)對(duì)健康足月母乳喂養(yǎng)新生兒腸道內(nèi)雙歧桿菌定植的影響大于對(duì)乳桿菌的影響. 4.先天性消化道畸形新生兒術(shù)后腸道雙歧