消化道共生菌對(duì)結(jié)腸炎癥的影響.pdf

1、背景：結(jié)直腸癌（Colorectal Cancer,CRC）是一種常見的惡性腫瘤性疾病，也是一個(gè)由多因素引起和多階段產(chǎn)生的病癥。有關(guān)報(bào)道指出多種因素影響了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，例如遺傳背景、環(huán)境因素、飲食習(xí)慣、精神壓力和人口老齡化等。最近研究發(fā)現(xiàn)，隨著疾病的難以治愈和炎癥的不斷加重，發(fā)生結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)也逐步提升。目前，人們對(duì)于結(jié)腸癌的作用機(jī)制和發(fā)病原因尚不清楚。在人類健康和疾病發(fā)展過程中，腸道菌群被認(rèn)為是一種被遺忘的器官，它通過各種復(fù)雜的機(jī)

2、制維持著腸道平衡。最近有大量的研究報(bào)道表明，腸道微生物群也可以作為一種在結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展中起主要作用的因素。許多學(xué)者根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果和動(dòng)物模型構(gòu)建提出了菌群在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的作用,但由于研究的局限性，只能初步了解腸道菌群的致病機(jī)制,也局限于腫瘤在某個(gè)階段或者某些致病菌對(duì)腫瘤的影響，但是腸道菌群在結(jié)腸中的動(dòng)態(tài)變化和具體機(jī)制仍待進(jìn)一步探索。在這個(gè)微生物群時(shí)代，我們不僅要探索腸道菌群在結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用機(jī)制，還應(yīng)著重強(qiáng)調(diào)其潛在的臨床實(shí)踐意

3、義。如將基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果轉(zhuǎn)變成臨床應(yīng)用，將更好地體現(xiàn)腸道菌群在診斷和治療結(jié)直腸癌中的重要臨床價(jià)值。
　　目的：根據(jù)前期工作基礎(chǔ)和文獻(xiàn)報(bào)道，我們選取了幾種代表性的腸道菌：嗜酸乳桿菌pro15、肝螺旋桿菌51448、具核梭桿菌25586和產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌43860等，通過實(shí)驗(yàn)探究，觀測(cè)幾種代表性腸道菌在結(jié)腸炎向結(jié)腸癌轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　?。?）我們利用給小鼠腹腔注射12.5 mg/kg劑量的氧化

4、偶氮甲烷（azoxymethane,AOM），并且給小鼠飲用2％葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium,DSS）水的聯(lián)合誘導(dǎo)作用，建立了結(jié)腸癌的小鼠模型，這個(gè)模型可以很好的模擬潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)病人的結(jié)腸炎惡性轉(zhuǎn)化為結(jié)腸癌的過程。用肝螺旋桿菌51448和嗜酸乳桿菌pro15給C57/B6小鼠灌胃后，取結(jié)腸固定，利用HE染色和組化進(jìn)行組織學(xué)觀察，辨別腫瘤的惡化程度及性質(zhì)。

5、　?。?）利用LPS+D-GalN構(gòu)建小鼠急性肝功能損傷模型。腹腔注射LPS/GalN，按照LPS:35μL/kg，GalN:800μg/kg，每只小鼠6μL/g的劑量給藥。
　　（3）用具核梭桿菌25586和產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌43860給APC模型小鼠灌胃后，取結(jié)腸固定，利用HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察，辨別腫瘤的惡化程度及性質(zhì)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)白介素6（IL-6）、白介素17（IL-17）、γ干擾素（IFN-γ）、

6、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子受體（TNF-α）等，分析兩種細(xì)菌對(duì)炎癥細(xì)胞因子的影響，從分子水平探究有關(guān)的作用機(jī)制。取小鼠腸系膜淋巴結(jié)，分別用抗小鼠的CD4、IFN-α、IL-17和FOXP3抗體進(jìn)行表面marker染色和胞內(nèi)因子染色，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)不同組小鼠腸道內(nèi)促炎和抗炎反應(yīng)水平。取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別與具核梭桿菌25586和產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌43860的體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，分別用62.5×106cfu、31.3×1

7、06cfu、15.6×106cfu、7.8×106cfu、0cfu劑量的兩種細(xì)菌刺激巨噬細(xì)胞24小時(shí)后，收集細(xì)胞上清，ELISA檢測(cè)TNF-α和IL-6水平。
　　結(jié)果：
　?。?）在結(jié)腸癌小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，肝螺旋桿菌51448組和嗜酸乳桿菌pro15組小鼠生存率均高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比在結(jié)腸長度并無差異，但是對(duì)照組小鼠腫瘤數(shù)量比實(shí)驗(yàn)組小鼠多。HE染色和組化結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸內(nèi)炎癥細(xì)胞因子水平和對(duì)照組相比無顯著差異

8、。
　?。?）在小鼠急性肝損傷模型實(shí)驗(yàn)中，肝螺旋桿菌51448組小鼠生存率高于對(duì)照組。
　?。?）具核梭桿菌25586、產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌43860組與對(duì)照組相比，結(jié)腸長度，瘤子數(shù)量沒有明顯差異，但是通過進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)25586組小鼠結(jié)腸組織培養(yǎng)上清中的IL-17、IFN-γ、IL-1β、TNF-α和IL-6等炎性細(xì)胞因子水平明顯高于對(duì)照組，提示25586介導(dǎo)了結(jié)腸的炎癥反應(yīng)，對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)展有顯著的促進(jìn)作用。438

9、60細(xì)菌能夠促進(jìn)部分炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，有促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)展的趨勢(shì)。根據(jù)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，在CD4+T細(xì)胞中，我們可以看出25586組和43860組小鼠結(jié)腸內(nèi)產(chǎn)生IFN-γ和IL-17的水平比對(duì)照組顯著增多，而T-reg陽性細(xì)胞的比例與對(duì)照組相比顯著減少。根據(jù)體外共培養(yǎng)的ELISA結(jié)果可知，與不加細(xì)菌刺激的對(duì)照組相比，25586細(xì)菌和43860細(xì)菌均能刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-6，并且25586刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子的能力更強(qiáng)