山定子低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子CBF基因（MbCBF）的克隆及其在擬南芥中的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、低溫寒害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一種嚴(yán)重自然災(zāi)害，世界上每年因此造成的損失高達(dá)2000億美元。作物的抗寒性狀是由多基因控制的，只有成簇抗性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活，才能有效提高作物的抗寒能力?？寺〔㈣b定調(diào)控抗寒功能基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子成為這一研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)從多種植物中發(fā)現(xiàn)CBF(C-repeat Binding factors)冷調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，其功能也已得到驗(yàn)證。CBF轉(zhuǎn)錄激活因子可與COR(cold-rcgulated)基因啟動(dòng)子區(qū)域的CRT

2、/DRE(C-repeat/dehydration responsive element)調(diào)控元件特異結(jié)合，并激活一系列COR蛋白的表達(dá)，從而提高植物的耐寒性。本文利用PCR技術(shù)，首次從抗寒植物山定子中分離低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF基因，并進(jìn)行了克隆與序列分析(基因銀行注冊(cè)號(hào)碼為EF582842)；同時(shí)，構(gòu)建了山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF基因的植物表達(dá)載體，并通過花序浸泡法進(jìn)行了擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化研究，主要的研究結(jié)果如下： 1.通過將GenB

3、ank上發(fā)表的幾種植物的CBF同源基因進(jìn)行比較在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)兼并引物，采用RT-PCR和常規(guī)PCR方法對(duì)山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF基因中間片段進(jìn)行克隆，得到一大小為461bp的片段，并在此中間片段基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異引物，采用反向PCR方法對(duì)山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF基因的旁側(cè)序列進(jìn)行克隆，結(jié)果獲得一長(zhǎng)度為1841bp的片段，與中間片段拼接得到一大小為2284bp的片段，其中包含完整的開放閱讀框從第790位的起始密碼子到第1545位的終止密碼

4、子，推測(cè)的編碼蛋白的氨基酸序列含251個(gè)氨基酸殘基。然后在預(yù)測(cè)的編碼區(qū)兩端設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物對(duì)山定子基因組進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果得到的序列與拼接所得的序列在編碼區(qū)內(nèi)完全一致。應(yīng)用DNAman軟件將推測(cè)的山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF基因編碼區(qū)與Genebank上發(fā)表的幾種植物CBF基因進(jìn)行氨基酸同源性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山定子CBF轉(zhuǎn)錄因子MbCBF和櫻桃(Prunusavium)DREB基因的氨基酸同源性為66.93％；與橡膠樹(Hevea brasili

5、ensis)同源性為55％，這說明我們已經(jīng)成功地克隆了山定子轉(zhuǎn)錄因子MbCBF基因。 2.對(duì)山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF基因的核苷酸序列以及由此推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行了序列比對(duì)和功能、結(jié)構(gòu)分析，得出以下結(jié)論： 1) 山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF基因與其它植物CBF基因在核苷酸和氨基酸水平上有很高同源性； 2) 山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF基因編碼一酸性蛋白，等電點(diǎn)pI為5.01，預(yù)測(cè)分子量為27.9KD； 3)山定子轉(zhuǎn)錄因子CB

6、F氨基酸序列含有一個(gè)功能區(qū)AP2結(jié)合域。在AP2結(jié)合域的兩端擁有PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR兩段短多肽序列； 4)山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF氨基酸序列擁有酸性活化區(qū)域，無核定位信號(hào)和信號(hào)肽，無跨膜結(jié)構(gòu)； 5)山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF氨基酸序列中有和CBF家族中保守的α螺旋區(qū)和β折疊區(qū)； 6)用同源建模法模擬出山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF’的空間結(jié)構(gòu)模型； 7)通過對(duì)山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析得出，

7、山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF基因與蘋果屬櫻桃的DREB基因具有相近的起源。 3.構(gòu)建山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF基因的植物表達(dá)載體，即首先設(shè)計(jì)一對(duì)含有BamH Ⅰ和SacⅠ酶切位點(diǎn)的特異引物P5F、P5R，從山定子基因組DNA中分離CBF基因的編碼區(qū)。然后應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SacⅠ分別對(duì)質(zhì)粒pBI121和PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，用酶切的PCR產(chǎn)物替換質(zhì)粒pBI121中的GUS基因，獲得山定子轉(zhuǎn)錄因子CBF基因的植物表達(dá)載體pBC35S。