大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及其表達(dá)研究.pdf

1、通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控目的基因的表達(dá)，是植物對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育及生理代謝調(diào)控的一種重要方式。MYB轉(zhuǎn)錄因子基因是最大的植物轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一，參與植物次生代謝調(diào)控、激素和環(huán)境因子的應(yīng)答，并對(duì)細(xì)胞分化、細(xì)胞周期以及植物葉片等器官的形態(tài)建成具有重要的調(diào)節(jié)作用。大豆是重要的油料作物，同時(shí)也是蛋白和異黃酮的重要來(lái)源，而大多數(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物類黃酮的代謝均有調(diào)控作用。因此，本文以大豆為研究材料，從中分離克隆新的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，以期為MY

2、B轉(zhuǎn)錄因子在類黃酮的生物合成調(diào)控及其脅迫應(yīng)答等方面的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1.根據(jù)植物中MYB基因DNA結(jié)合域保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以大豆品種中豆27、吉林3號(hào)、淮豆1號(hào)及張家口黑豆的葉片為材料，RT-PCR.擴(kuò)增出14個(gè)MYB基因同源片段；據(jù)此設(shè)計(jì)基因特異引物，通過(guò)RACE-PCR分離克隆出4個(gè).MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，GmMYBZ1(DQ902862)、GmMYBZ2(DQ902861)、GmMYBJ61(D

3、Q902863)和GmMYBJ7(DQ902864)；氨基酸序列比對(duì)表明，這4個(gè)基因分別具有兩個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域，為典型的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子基因。 2.半定量RT-PCR.對(duì)這4個(gè)基因的組織特異性表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果只在葉片中檢測(cè)到了GmMYBJ6的表達(dá)，在莖和葉中分別檢測(cè)到了GmMYBZl和GmMYBJ7的表達(dá)，而GmMYBZ2在植物的根、莖、葉及未成熟種子中均有表達(dá)。對(duì)脅迫應(yīng)答的檢測(cè)結(jié)果顯示，在紫外輻射、高鹽及干旱(PE

4、G)條件下，隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，GmMYBJ6的表達(dá)量增加，而GmMYBZ2和GmMYBJ7的表達(dá)量降低。 3.以基因組DNA為模板對(duì)GmMYBZ1、GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)序列分析表明，GmMYBZ1不含內(nèi)含子，GmMYBZ2含有1個(gè)內(nèi)含子，而GmMYBJ6和GmMYBJ7分別含有2個(gè)內(nèi)含子。 4.構(gòu)建四個(gè)酵母效應(yīng)質(zhì)粒pBridge-GmMYBZ1、pBridge-Gm

5、MYBZ2、pBridge-GmMYBJ6和pBridge-GmMYBJ-7，轉(zhuǎn)入酵母菌株AHl09中，并分別在缺少色氨酸的SD培養(yǎng)基和缺少色氨酸、組氨酸的SD雙缺陷培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。酵母表達(dá)表明，GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7均具有明顯的轉(zhuǎn)錄激活功能，β-半乳糖苷酶活性分別為10.35U、28.48U和24.31U，Whatman濾紙顯色反應(yīng)均能呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色；而GmMYBZ1酵母轉(zhuǎn)化株的β-半乳糖苷酶活性僅為

6、3．59U，Whatman濾紙顯色反應(yīng)未能呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色。 5．構(gòu)建綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體，基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果表明，GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7蛋白均定位于細(xì)胞核中，與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)一致。 6．構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-GmMYBZ2、pCAMBIA2301-GmMYBJ6和pCAMBIA2301-GmMYBJ7，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草NC89；通過(guò)Kan抗性

7、、Gus染色及RT-PCR篩選鑒定陽(yáng)性苗；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，GmMYBJ6可提高類黃酮代謝途徑中的苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、4-香豆酰輔酶A連接酶(4CL)、查爾酮合成酶(CHS)、黃酮醇合成酶(FLS)等關(guān)鍵酶的表達(dá)，結(jié)果在GmMYBJ6表達(dá)的煙草中，總黃酮含量增加；而由于GmMYBZ2和GmMYBJ7抑制了多數(shù)類黃酮代謝途徑中基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化煙草中總黃酮含量減少。耐脅迫檢測(cè)結(jié)果表明，G