大豆MYB轉錄因子基因的克隆及其表達研究.pdf

1、通過轉錄因子在轉錄水平上調(diào)控目的基因的表達，是植物對其生長發(fā)育及生理代謝調(diào)控的一種重要方式。MYB轉錄因子基因是最大的植物轉錄因子基因家族之一，參與植物次生代謝調(diào)控、激素和環(huán)境因子的應答，并對細胞分化、細胞周期以及植物葉片等器官的形態(tài)建成具有重要的調(diào)節(jié)作用。大豆是重要的油料作物，同時也是蛋白和異黃酮的重要來源，而大多數(shù)MYB轉錄因子對植物類黃酮的代謝均有調(diào)控作用。因此，本文以大豆為研究材料，從中分離克隆新的MYB轉錄因子基因，以期為MY

2、B轉錄因子在類黃酮的生物合成調(diào)控及其脅迫應答等方面的研究提供一定的理論基礎。主要研究結果如下： 1.根據(jù)植物中MYB基因DNA結合域保守區(qū)設計簡并引物，以大豆品種中豆27、吉林3號、淮豆1號及張家口黑豆的葉片為材料，RT-PCR.擴增出14個MYB基因同源片段；據(jù)此設計基因特異引物，通過RACE-PCR分離克隆出4個.MYB轉錄因子基因，GmMYBZ1(DQ902862)、GmMYBZ2(DQ902861)、GmMYBJ61(D

3、Q902863)和GmMYBJ7(DQ902864)；氨基酸序列比對表明，這4個基因分別具有兩個MYB結構域，為典型的R2R3MYB轉錄因子基因。 2.半定量RT-PCR.對這4個基因的組織特異性表達情況進行了檢測，結果只在葉片中檢測到了GmMYBJ6的表達，在莖和葉中分別檢測到了GmMYBZl和GmMYBJ7的表達，而GmMYBZ2在植物的根、莖、葉及未成熟種子中均有表達。對脅迫應答的檢測結果顯示，在紫外輻射、高鹽及干旱(PE

4、G)條件下，隨著處理時間的增長，GmMYBJ6的表達量增加，而GmMYBZ2和GmMYBJ7的表達量降低。 3.以基因組DNA為模板對GmMYBZ1、GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7進行了PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)序列分析表明，GmMYBZ1不含內(nèi)含子，GmMYBZ2含有1個內(nèi)含子，而GmMYBJ6和GmMYBJ7分別含有2個內(nèi)含子。 4.構建四個酵母效應質粒pBridge-GmMYBZ1、pBridge-Gm

5、MYBZ2、pBridge-GmMYBJ6和pBridge-GmMYBJ-7，轉入酵母菌株AHl09中，并分別在缺少色氨酸的SD培養(yǎng)基和缺少色氨酸、組氨酸的SD雙缺陷培養(yǎng)基上篩選陽性轉化子。酵母表達表明，GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7均具有明顯的轉錄激活功能，β-半乳糖苷酶活性分別為10.35U、28.48U和24.31U，Whatman濾紙顯色反應均能呈現(xiàn)出明顯的藍色；而GmMYBZ1酵母轉化株的β-半乳糖苷酶活性僅為

6、3．59U，Whatman濾紙顯色反應未能呈現(xiàn)出明顯的藍色。 5．構建綠色熒光蛋白融合表達載體，基因槍法轉化洋蔥表皮細胞進行瞬時表達，結果表明，GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7蛋白均定位于細胞核中，與亞細胞定位預測一致。 6．構建植物表達載體pCAMBIA2301-GmMYBZ2、pCAMBIA2301-GmMYBJ6和pCAMBIA2301-GmMYBJ7，利用農(nóng)桿菌介導法轉化煙草NC89；通過Kan抗性

7、、Gus染色及RT-PCR篩選鑒定陽性苗；RT-PCR檢測結果顯示，GmMYBJ6可提高類黃酮代謝途徑中的苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、4-香豆酰輔酶A連接酶(4CL)、查爾酮合成酶(CHS)、黃酮醇合成酶(FLS)等關鍵酶的表達，結果在GmMYBJ6表達的煙草中，總黃酮含量增加；而由于GmMYBZ2和GmMYBJ7抑制了多數(shù)類黃酮代謝途徑中基因的表達，從而導致轉化煙草中總黃酮含量減少。耐脅迫檢測結果表明，G