深海洋中脊沉積物砷抗性菌的多樣性分析.pdf

1、自然界中的微生物在砷的生物地球化學(xué)循環(huán)中起著重要作用。海洋砷的主要來源是巖漿活動(dòng),深海熱液口活動(dòng)是砷的一個(gè)重要來源。微生物通過累積、甲基化、氧化、還原等作用參與砷價(jià)態(tài)改變和元素循環(huán),但是目前關(guān)于海洋環(huán)境的砷抗性菌知之甚少,尤其是深海環(huán)境。為了解深海環(huán)境中的微生物主要的砷抗性細(xì)菌,本論文對(duì)印度洋、大西洋中脊深海沉積物砷抗性菌的多樣性進(jìn)行研究。
　　 本文用含有2 mmol/L NaAsO2的PTA培養(yǎng)基富集來自印度洋和大西洋七個(gè)不

2、同站點(diǎn)的深海沉積物樣品,得到七個(gè)砷抗性菌群。我們對(duì)這些菌群的砷抗性菌進(jìn)行了篩選,同時(shí)構(gòu)建16SrDNA文庫(kù)與DGGE相結(jié)合的方法對(duì)其中三個(gè)菌群(站點(diǎn)IR-TVG1、IRTVG2、IR-TVG3)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析；分析了不同培養(yǎng)時(shí)間和不同砷濃度下IR-TVG2、IR-TVG3站點(diǎn)的抗性菌群結(jié)構(gòu)的變化。
　　 從七個(gè)砷抗性菌群中共分離到102株單菌,分屬于28個(gè)屬50個(gè)種,主要為變形菌綱α和γ亞群與Actinobacteria(放線

3、菌門,高G+C革蘭氏陽性菌)類群。微桿菌、食烷菌、海桿菌、Idiomarina、鹽單胞菌和假交替單胞菌占優(yōu)勢(shì),其中1株菌可能屬于新屬新種,15株菌可能屬于新種。
　　 通過構(gòu)建16SrDNA文庫(kù)與DGGE結(jié)合的方法,確定站點(diǎn)IR-TVG1抗性菌群中的優(yōu)勢(shì)抗性菌為假交替單胞菌;站點(diǎn)IR-TVG2抗性菌群中的優(yōu)勢(shì)抗性菌為食烷菌與微桿菌；站點(diǎn)IR-TVG3抗性菌群中的優(yōu)勢(shì)抗性菌為微桿菌。從IR-TVG2、IR-TVG3分離到的微桿菌雖

4、然16S rRNA序列完全一樣,但它們的重復(fù)PCR指紋圖譜和砷抗性能力不一樣。
　　 為了了解取樣時(shí)間和砷濃度對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的影響,我們選取IR-TVG2、IR-TVG3站點(diǎn)的抗性菌群做進(jìn)一步的DGGE分析。結(jié)果顯示,不同取樣時(shí)間和不同砷濃度下兩站點(diǎn)的抗性菌群結(jié)構(gòu)變化明顯。在2mM富集培養(yǎng)條件下,IR-TVG2在培養(yǎng)的初期只有一優(yōu)勢(shì)條帶,但28h后出現(xiàn)另一條優(yōu)勢(shì)條帶；但在20mM富集培養(yǎng)條件下沒有隨時(shí)間發(fā)生變化。IR-TVG3在兩種

5、濃度的富集培養(yǎng)條件下,菌群結(jié)構(gòu)一直沒有變化。在0-60mM的砷濃度下,IR-TVG2樣品的優(yōu)勢(shì)條帶隨著砷濃度的提高而變少,而IR-TVG3樣品,在低濃度砷富集培養(yǎng)條件下僅一條優(yōu)勢(shì)條帶,但隨著砷濃度的提高而出現(xiàn)了第2條優(yōu)勢(shì)條帶。
　　 對(duì)篩選到的102株單菌進(jìn)行了砷抗性范圍測(cè)定,可在10mM NaAsO2存在下正常生長(zhǎng)的菌株僅占總菌數(shù)的16.6％,這些高抗性的單菌主要篩選自IR-TVG2和IR-TVG3。這可能是這兩站點(diǎn)混合菌群比

6、其他菌群抗性高的因?yàn)?。這些具有高抗性的菌株主要屬于Microbacterium屬,占52.6％；但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,菌株抗性與種屬?zèng)]有必然聯(lián)系,同屬甚至同種的細(xì)菌有時(shí)表現(xiàn)出差異極大的抗性能力。此外不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件,相同的菌株也會(huì)表現(xiàn)出差異的抗性能力。
　　 利用兼并引物擴(kuò)增砷流出泵基因(arsB與ACR3),共獲得17個(gè)目的大小的基因片段,測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示,這些基因與已報(bào)道的砷流出泵基因相似度在75％左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,單菌是否

7、具有砷流出泵與其種屬和抗性能力沒有必然聯(lián)系。在獲得的優(yōu)勢(shì)菌中,均未擴(kuò)的砷流出泵基因,說明它們存在其他的砷抗性機(jī)制。
　　 對(duì)從熱液口蝦的頭部富集分離到的單菌D8—2(Brachybacterium paraconglomeratum,100％)進(jìn)行初步的研究,結(jié)果顯示該菌具有良好的砷抗性能力,但不具有砷氧化能力,D8—2對(duì)砷具有很好的胞內(nèi)累積作用,累積量達(dá)到2313.7μg As g-1細(xì)胞干重,為目前的細(xì)菌砷累積量之最高。