YAP+shRNA載體的構(gòu)建及對肺腺癌細胞株A549生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景：
　　肺癌是人體最常見的惡性腫瘤之一，隨著工業(yè)的進步、大自然環(huán)境的污染和人口的老齡化，近些年來肺癌的發(fā)病率和死亡率逐漸升高，現(xiàn)在在多數(shù)發(fā)達國家肺癌已成為了惡性腫瘤的第一位，這與工業(yè)的發(fā)展、環(huán)境污染和人口老齡化有關(guān)?，F(xiàn)在肺癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療已成為了全球關(guān)注的問題。根據(jù)世界衛(wèi)生組織癌癥研究所2010年發(fā)布的癌癥報告示：2009年肺癌新發(fā)病例約為171萬，死亡約140萬?，F(xiàn)在在我國的肺癌發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第一位和第二位

2、。其中的多數(shù)患者發(fā)病時的年齡超過了四十歲，而且統(tǒng)計顯示近些年來女性患者發(fā)病率不斷上升，發(fā)病的男女比例由以前的4:1上升到了現(xiàn)在的1.5:1。肺癌的發(fā)病原因很復(fù)雜，目前的流行病學(xué)研究顯示主要與環(huán)境污染、吸煙和職業(yè)因素等有關(guān)。這些因素作用于基因，導(dǎo)致基因突變?，F(xiàn)已查明肺癌中有多種抑癌基因失活或癌基因突變。在細胞中抑癌基因的失活和癌基因的突變可以導(dǎo)致惡性腫瘤細胞增殖的能力增強。并且惡性腫瘤細胞增殖時可以重疊生長，惡性腫瘤細胞的接觸性抑制消失，

3、細胞能向三維空間生長，形成層狀堆積物?，F(xiàn)在肺癌的治療手段主要有手術(shù)、化療、放療和生物治療等。據(jù)回顧性研究發(fā)現(xiàn)雖然現(xiàn)在手術(shù)仍然治是療肺癌最有效的手段，但是肺癌早期沒有任何的外部表現(xiàn)癥狀，在患者出現(xiàn)外部表現(xiàn)癥狀去醫(yī)院就診時，很多患者已進入了中后期，錯過了通過手術(shù)治療肺癌的最佳時期。由于惡性腫瘤是在基因水平引起的一種疾病，因此惡性腫瘤的靶向治療已成為現(xiàn)今研究的一個熱點。Hippo信號傳導(dǎo)通路最早是由于果蠅Ste20樣激酶Hippo而命名的信號

4、傳導(dǎo)通路。Hippo通路的主要生物學(xué)功能有：調(diào)控細胞的分化和器官大小，維持細胞凋亡增殖的動態(tài)平衡，維護人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，調(diào)節(jié)細胞的接觸性抑制，并且可以導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。在人體內(nèi)，Hippo通路也參與細胞增殖的負調(diào)控，YAP磷酸化后是抑制轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子。最近有些實驗表明 YAP是一個癌基因，可以促使正常細胞向惡性腫瘤細胞方向分化，例如YAP mRNA和YAP蛋白在胰腺癌細胞、肝癌細胞以及結(jié)腸癌細胞中的表達明顯上調(diào)。YAP是Hippo信號傳

5、導(dǎo)通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子，YAP可以抑制惡性腫瘤細胞的凋亡，增強惡性腫瘤細胞的增殖能力，并且可以使惡性腫瘤細胞的接觸性抑制能力消失。但是在某些情況下 YAP作為促癌因子促進惡性腫瘤發(fā)生的時候，還具有促進凋亡的能力。例如當(dāng) DNA受損傷時，PML可使 YAP及 p73蛋白進入細胞的細胞核內(nèi)，對轉(zhuǎn)錄激活因子有輔助作用，同時YAP可以增強與p73相關(guān)的凋亡基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。另外，有人在研究乳腺癌細胞時發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞中的YAP表達明顯下調(diào)甚至

6、缺失，并且乳腺癌細胞中的YAP缺失可以導(dǎo)致更強的浸潤和轉(zhuǎn)移能力。所以有些研究者表示 YAP作為癌基因的角色需要重新的定位。本實驗首先對手術(shù)患者正常的肺組織和肺腺癌組織用免疫組化檢測 YAP的定位，以了解YAP蛋白在正常的肺組織和肺腺癌組織中的表達情況，然后構(gòu)建YAP干擾質(zhì)粒并用構(gòu)建的干擾質(zhì)粒干擾YAP基因的表達，最后用CCK8和Transwell小室來檢測肺腺癌細胞在增殖和侵襲能力方面的改變。以探討相關(guān)作用機制，尋找肺腺癌治療的新靶點。

7、
　　目的:
　　檢測正常的肺組織和肺腺癌組織中YAP蛋白的表達情況，構(gòu)建YAP+shRNA干擾質(zhì)粒然后對肺腺癌細株A549進行轉(zhuǎn)染，檢測YAP對肺腺癌細胞株A549的生物學(xué)行為的影響，以尋求肺腺癌靶向治療的新靶點。
　　方法:
　　1．運用免疫組化來檢測YAP蛋白在肺腺癌組織和正常組織中的表達情況。
　　2．根據(jù)信息資源檢索，然后根據(jù)位點，設(shè)計出4個shRNA質(zhì)粒載體（shRNA1, shRNA2,shR

8、NA3,shRNA4)和一個陰性對照的質(zhì)粒載體(NCRNA)，運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細胞株，在熒光顯微鏡下觀測綠色熒光蛋白的表達情況，然后采用有限稀釋法建立起穩(wěn)定低表達 YAP基因的肺腺癌 A549細胞系，運用 RT-PCR和western-blot來檢測YAP在該細胞中的表達情況。
　　3．最后運用CCK8和Transwell小室來檢測各組細胞株中的增殖能力和侵襲能力的情況。
　　結(jié)果:
　　YAP蛋白在肺腺癌

9、組織中高表達，YAP蛋白在正常肺組織中不表達或者低表達。用熒光顯微鏡、RT-PCR和western-blot可顯示細胞轉(zhuǎn)染成功且可以挑出轉(zhuǎn)染效率最優(yōu)的細胞株。采用CCK8和Transwell小室檢測到轉(zhuǎn)染后的細胞株與肺腺癌A549細胞株相比較，增殖能力和侵襲能力有所下降。
　　結(jié)論:
　　肺腺癌組織與正常肺組織相比較，肺腺癌組織中 YAP蛋白表達高。構(gòu)建成功的YAP+shRNA干擾質(zhì)?？梢越档头蜗侔〢549細胞系中YAP蛋白